(论文)FGFR3在大鼠肝硬化模型中的动态表达研究

外科理论 与实践 2 0 0 9年第 1 4卷第 6期 6 2 7 论 著 F G F R 3在大鼠肝硬化模型 中的动态表达研究 张贵 阳 ， 杨卫 平 ， 陈 皓 ， 施敏 敏 ， 孙 广 涛 ， 杜 海磊 ， 邱 伟 华 ( 上 海 交通大 学 医学 院附 属瑞 金 医院外 科 消 化外 科研 究所 ， 上 海2 0 0 0 2 5) 摘要】 目的 ： 观察大 鼠肝硬化形成过程 中成纤维细胞生长因子受体 3 ( F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t 0 r r e c e p t 0 r 3 ， F G F R 3 ) 的表达变化 。 方法 ： 7 0只雄性 s D大鼠， 随机取 1 0只作 为对照组 ， 其余 6 0只作为肝硬 化组 。 采用剂量频次渐变式四氯 化碳 ( C C I ) 腹腔内注射建立肝硬化大 鼠模 型 。检测 2组 大鼠的血清 A I J T 、 体 重 、 肝体 比 ， 病理组 织行包括 H E和嗜银 染 色 ， 并采 用荧光定量 聚合酶链反应 ( r e a l t i m e P C R) 和蛋 白质 印迹 ( We s t e r n b l 0 t ) 检测 F G F R 3基 因和相应蛋 白在肝 硬化形成过程 中的表达变化 。结果 ： 肝硬化组大 鼠的 血清 A L T 、 肝体 比和死亡率 均显 著高于对 照组 ( P均 0 0 1 ) ； 而体 重 则显 著低 于对 照组 ( P 0 0 1 ) ； 肝硬化组大 鼠肝组织大体观察 、 H E染色及 嗜银 染色均呈 明显肝硬化表 现 ， 而对照组 则无该表现 ； r e a l t i m e P C R及 We s t e rn b l o t 结果显示 ， F G F R 3在肝硬化形成 过程 中总体表达逐渐增 强 结论 ： 剂量 频 次渐变式 G E l 腹腔 内注射法是一种高效 、 低成本的大鼠肝硬化建模方法。而肝组织 F G F R 3在肝硬化发 生 、 发展过程 中 的动 态表 达 在 一 定 程 度 上 反 映 了肝 纤 维 化 及 肝 硬 化 程 度 。 关键词 ： 肝硬化 ； 四氯化碳 ； 成纤维生长 因子受体 中图分类号 ： R 3 9 2 3 文献识别码 ： A 文章编号 ： 1 0 0 7 9 6 1 0 ( 2 0 0 9 ) 0 6 0 6 2 7 0 5 Th e e x p e r i m e n t a l i n v e s t i g a t i o n i n t o t h e e x pr e s s i o n o f fi b r o b l a s t 3 g r o wt h f a c t o r r e c e p t o r i n t h e h e p a t i c t i s s u e s d u r i n g t h e d e v e l o p m e n t o f h e p a t i c c i r r h o s i s i n r a t s Z HANG G u i y a n g ,Y ANG We i - p i n g , C HEN Ha o ， S HI Mi n rai n ， S U N G u a n t a o ，D U Ha l l e i ，Q I U We i h u c a S h a n g h a i I n s t i t u t e o f D i g e s t i v e S u r g e r y ，Ru ij i n Ho s p i t a l ，S h a n g h a i J i a o t o n g U n i v e r s i t y S c h o o l o fMe d i c i n e ， S h a n g h a i 2 0 0 0 2 5 , C h i n a Ab s t r a c t Ob j e c t i v e T o m o n i t o r t h e e x p r e s s i o n o f F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r 3( F G F R 3 ) i n h e p a t i c t i s s u e s d u ri n g t h e d e v e l o p me n t o f h e p a t i c c i r r h o s i s i n r a t s M e t h o d s S e v e n t y ma l e S D r a t s we r e r a n d o ml y d i v i d e d i n t o t w o g r o u ps Te n r a t s s e r v e d a s t h e c o n t r o l g r o u p an d o t he r r a t s we r e e mpl o ye d a s t h e l i v er c i r r ho s i s mo d e l s Th e mo de l s o f h e p a t i c c i rr h o s i s w a s e s t a b l i s h e d b y g r a d u a l l y i n c r e a s i n g t h e fr e q u e n c y a n d d o s a g e o f i n t r a p e r i t o n e a l i n j e c t i o n o f c a r b o n t e t r a c h l o r i d e f C C 1 4 ) T h e b o d y w e i g h t r a t i o b e t w e e n l i v e r w e i g h t a n d b o d y w e i g h t a n d s e rnm A I JT w e r e m e a s u r e d He p a t i c p a t h o l o g i c a l s t a t u s b y HE s t a i n i n g a n d a r g y r o p h i l g r a n u l e s s t a i n i n g we r e o b s e r v e d T h e e x p r e s s i o n o f F GF R3 g e n e a n d p r o t e i n i n h e p a t i c c i rrh o t i c t i s s u e s we r e d e t e c t e d b y r e a l t i me P CR a n d W e s t e r n b l o t d u r i n g t h e d e v e l o p me n t o f c i r r h o s i s Re s u l ts Th e s e r t n n AI Jr r l e v e l i n t he g r o up wi t h he pa t i c c i rrh o s i s was s i g ni fic a nt l y hi g he r t ha n t ha t o f t he co nt r o l g r o u p f P 0 o 1 ) T h e r a t i o b e t w e e n l i v e r w e i g h t a n d b o d y w e i g h t i n t h e g r o u p w i t h h e p a t i c c i r r h o s i s w a s s i g n i fi c a n t l y l o w e r t h a n t h a t o f t h e c o n t r o l g r o u p f 尸 O O 1 ) T h e s u rvi v a l r a t e i n t h e g r o u p w i t h h e p a t i c c i r r h o s i s w a s a l s o l o w e r s i g n i fi c a n t l y t h a n t h a t o f t h e c o n t r o l g r o u p f p 0 O 1 ) P a t h o l o g i c a l m a n i f e s t a t i o n o f h e p a t i c c i r r h o s i s w a s o b s e r v e d i n t h e e x p e r i m e n t a l g r o u p T h e e x p r e s s i o n o f F GF R3 g e n e a n d p r o t e i n i n c r e a s e d g r a d u a l l y d u r i n g t h e d e v e l o p me n t o f h e p a t i c c i rrh o s i s Co n c l u s i o n s T h e m e t h o d o f g r a d u a l b r i n c r e a s i n g t h e f r e q u e n c y a n d d o s a g e o f i n t r a p e r i t o n e a l i n j e c t i o n o f c a r b o n t e t r a c h l o r i d e w a s e f f e c t i v e a n d o f l o w c o s t f o r e s t a b l i s h i n g t h e mo d e l o f h e p a t i c c i rrh o s i s i n r a t s T h e d y n a mi c e x p r e s s i o n o f F GF R3 c o u l d r e fle c t t he d e g r e e o f he pa t i c fibr os i s o r c i rrh os i s Ke y wo r d s ： He p a t i c c i rrh o s i s ； C a r b o n t e t r a c h l o r i d e ； F i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r 有 研 究表 明 成 纤维 生 长 因子 ( fi b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ， F G F ) 可通过参与肝星状细胞 ( HS C ) 的激活 ， 进而促使其分泌大量 细胞外基质 ( E C M) 并沉积在 肝 内。 引起肝纤维化发生及发展I 1 l 。 F G F家族对应的 基金项 目： 国家 自然科学基金课题 ( 3 0 8 7 2 5 1 1 ) ； 上海 市青年 科技启明( 0 8 Q A1 4 0 4 7 ) 通讯作者 ： 邱伟华 ， E m a i h d r q w h 2 0 0 3 y a h o o c o i n 受 体 f fi b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r ， F G F R 1 主 要 有 4种亚型 ， 即 F G F R1 4， 但在发挥促纤维化功能的 过程 中主要作用于其 中何种受体来发挥效应至今 尚不 明确 以往 研究 发现 ， F G F R 3在肝 癌及 肝 硬化 组 织 中呈现 明显高表达l 3 l 。本研究 拟观察肝组织 F G F R 3在 四氯化碳f C C 1 4 1 诱导大 鼠肝硬化过程中的 表达 情 况 ， 进一 步 探究 F G F R 3在肝 纤 维 化发 生 、 发 展中所发挥的作用。 材料 与方 法 一 、材 料 1 实 验 动 物 ： 7 0只 健 康 雄 性 S p r a g u e D a w l e y ( S D) 大 鼠， 体重( 1 8 0 1 0 )g ， 购 自于中国科 学院上 海实 验动 物 中心 ： 大 鼠购 回后 在新 环 境 中适 应 性饲 养 3 d再 开始 实验 。所 有大 鼠均采 用统 一标 准给予 足量普 通饲 料 、 饮 水 。 2 主 要 试 剂 ： C C 1 ( 分 析 纯 ， 浓 度 9 9 5 ) 购 自 上海长江化工厂 ，市售食用色拉油 ， R N A抽提试 剂 ( T r i z o 1 )购 自I n v i t r o g e n公司 ，逆转 录试 剂盒 ( R e v e r T r a A c e 一 仅 T M) 及 即 时 定 量 P C R 试 剂 盒 ( R e a 1 t i me P C R Ma s t e r Mi x S Y B R G r e e n ) 均 购 自 日 本 T O Y O B O公司， d N T P 、 G o T a q D N A聚合酶购 自美 国 P r o m e g a 公 司 ， 蛋 白抽 提 液 、 B C A蛋 白定 量 试 剂 盒及 5 蛋 白上 样 缓 冲液 均 购 白美 国 P i e r c e公 司 ， 兔抗 鼠 F G F R 3多克 隆抗体及碱性磷 酸酶抗兔 二 抗 均 购 自 S a n t a C r u z 公 司 苏 木精 伊 红 溶 液 、 双 氨 氢氧化银 ( G o m o r i 氨银 ) 溶液等试剂均 由本 院病理 科 提 供 。 二 、 方法 1 实验分组及肝硬化模型建立 ： 将 S D成年雄 性 大 鼠随机分 成 2组 正常 对照 组 ( n = 1 0 ) 和 肝硬 化 组 ( n = 6 0 ) ， 分别给予标号称重。 肝硬化组大鼠， 腹 腔注射 C C 1 与食 用色 拉油溶 液混 合配 制成 的 4 0 C C 1 食用油 溶液( 即 4份 C C 1 与 6份 食用油 混 匀) ， 详细给药方法见表 1 。对照组大鼠， 按同样 方案腹腔注射生理盐水( N S ) 。 表 1 大 鼠肝硬化建模给药 方案 2 标本采 集 ： 每次 给药前均称 重每 只大 鼠体重 。 分别 在 2 、 4 、 6 、 8周 随机从 实 验组 中取 出 1 0只大 鼠 处死， 并取肝组织标本 ， 第 1 0周将肝硬化组剩余大 鼠及 对照 组大 鼠全部 处死 。大 鼠处 死前 2 4 h禁食 ， 4 h禁水 ，依次称重后用 l戊巴比妥钠腹腔注射 麻醉( 4 0 mg k g体重 ) 。麻醉成 功后 ， 正 中切 口人 腹 ， 抽取腹主动脉血 5 m L， 置于生化管 中， 离心取 血清 ， 一 7 0 c ( = 下保存 ， 以备检测血清 A L T 。完整切下 肝脏， 称取重量， 将部分肝脏存储于液氮 中， 部分肝 组织 在 1 O甲醛 中 固定 。 3 R T P C R定量 检测 职 基 因表 达 ： 取 大 鼠 肝 组 织 5 0 1 0 0 mg ，用 T r i z o l 试 剂 提 取 总 R N A， R N A 的完整性 以甲醛凝胶变性 R N A电泳鉴定法 验 证 继 而取 1 t x g总 R N A， 采用 T O Y O B O R e v e r T r a A c e O t T M 试剂盒进行逆转 录合成第 一链 c D N A。 合成的 c D N A即可用于 P C R扩增或储存于一 2 0 下 备用 。 采 用 O l i g o 6 0软 件设 计 大 鼠 F G F R 3 P C R 引 物。引物序列 为 F G F R 3 f F o r w a r d ) 5 。 A G T G T G C G T G T A A C A G A T G 一 3 ， F G F R 3 ( R e v e r s e ) 5 A G C C A G C AG I r r T C r T A T C C ； 肋 ( R e v e r s e ) 5 一 A G T G A G C T T C C C G T T C A G 3 采 用 R T P C R Ma s t e r Mi x 3 内参 G A P D H 引 物序 列 为 G A P D H f F )5 一 C 1 G C C A T C G T G G A AG G 3 ， ( S YB R G r e e n ) ( 日本 T O YO B O公司) 试剂盒 ， 建立总体积为 2 5 L的R T P C R体系 d d H 2 O 8 5 Ix L ， S Y B R G r e e n Mi x 1 2 5 p L ， P r i me r s( F o r wa r d ) 1 Ix L， P r i me r s( Re v e r s e ) 1 t x L， c D N A 2 tx L ， P C R 反 应 条 件 为 9