离心技术20120911(2011级临床本科).ppt

分析与检测技术,主讲人：宋涛 生物化学与分子生物学教研室,以常用分析与检测实验技术为主线，以细胞与分子生物学、生物化学、免疫学、遗传学等学科内容为基础，使医学生初步掌握常用分析与检测实验技术的基本知识和技能、常规仪器设备的使用和保养，了解现代分子生物学技术的基本知识，熟悉各种检测指标的临床意义。,主讲内容：,一、离心原理与技术 二、常用标记技术 三、其它实验技术,离心原理与技术,离心技术是指利用旋转运动产生的离心力，根据物质的沉降系数或浮力密度的差别进行物质的分析、分离、浓缩和提纯的一种技术。,洗衣机的脱水筒,“棉花”糖的制作,汽车转弯,应用：分离、纯化样品及对已纯化的样品进行结构和性质分析。,离心技术是指利用旋转运动产生的离心力，根据物质的沉降系数或浮力密度的差别进行物质的分析、分离、浓缩和提纯的一种技术。,离心机（centrifuge）是实施离心技术的装置。 它主要用于将悬浮液中的固体颗粒与液体分开；或将乳浊液中两种密度不同，又互不相溶的液体分开（例如从牛奶中分离出奶油）；它也可用于排除湿固体中的液体，例如用洗衣机甩干湿衣服；特殊的超速管式分离机还可分离不同密度的气体混合物；利用不同密度或粒度的固体颗粒在液体中沉降速度不同的特点，有的沉降离心机还可对固体颗粒按密度或粒度进行分级。,离心技术的应用 1.用于工业生产的，如化工、制药、食品等 工业大型制备用的离心技术，转速都在 每分钟5000转以下。 2.用于生物、医学、化学等实验室分析研究 的，转速从每分钟几千到几万转以上，此 类技术的使用目的在于分离和纯化样品， 以及对纯化的样品有关性能进行研究。,内容：,第一节 离心技术的基本原理 第二节 离心设备 第三节 常用离心方法及应用,第一节 离心技术的基本原理,一、离心的一般原理 二、离心力和相对离心力 三、沉降速度 四、沉降系数 五、沉降时间 六、测定相对分子量,一.基本原理 1.离心力 （Centrifugal force，F）：是指悬浮颗粒在离心过程中所受的离开旋转中心轴的作用力。 F=ma=m2r F:离心力（g.cm/s2或达因） m:颗粒质量 a:加速度 :旋转角速度 r：旋转体离旋转轴的距离 n:每分钟的转数 = (rad/sec),2n,60,2.相对离心力 Relative centrifugal force (RCF) RCF 就是在离心场中颗粒所受的离心力相当于它受到的地球重力的倍数，称为重力加速度。 RCF=F离心力/F重力 =m2r/mg=2r/g g为重力加速度（980cm/sec2),若用 2n = (rad/sec) 60 (2n/60)2 RCF= x r 980 =1.11910-5 n2 r n：转子每分钟的转数(rpm),RCF= 1.11910-5 n2 r RCF =1.11910-5(12000)23.8 =6123g RCF =1.11910-5(12000)28.1 =13052g,Dole&Cotzias制作了转子速度和半径相对应的离心力列线图。,dx 2r2 (p-m) V= = . 2 X dt 9 d2 (p-m) = . 2 X 18 r： 球形粒子的半径 d：球形粒子的直径 ：流体介质的粘度数 p：粒子的密度 m：介质的密度,3.沉降速度 Sedimentation velocity (1)定义：指在强大离心作用下，单位时间内物质运动的距离。,p-m=0 即p=m V=0 S=0 粒子平衡 p-m0 即pm V0 S0 粒子达到某一位置后就达到平衡 p-m0 即pm1 V0 S0 粒子逆着离心方向上浮,4.沉降系数 Sedimentation coefficient (S) 样品沉降率 样品颗粒的大小 形状 密度 溶剂的粘度、密度 离心加速度,在一般情况下，样品的沉降特征可以用沉降系数来表示: S是指单位离心场中粒子移动的速度。 沉降速度 V S= = = 单位离心力 2 r,dx/dt,2 r,S在实际应用时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，量纲为秒。,5.沉降时间(Sedimentation Time, Ts) dx/dt S= 2X 1 dx dt= 2S X 1 lnX2/X1 积分得 t2-t1= S 2,X2为离心转轴中心至离心管底内壁的距离; X1为离心转轴至样品溶液弯月面之间的距离, 样品粒子完全沉降到底管内壁的时间(t2-t1)用Ts表示则式可改为 1 lnXmax-lnXmin Ts= S 2 Ts以小时为单位,S以Svedberg为单位。,第二节 离心设备,一、离心机 二、离心机的基本构造 三、离心转头 四、离心管 五、离心机使用注意事项,一、离心机,离心机的基本构造,驱动电机、制冷系统、真空系统、显示系统、自动保护系统、控制系统、光学检测系统（分析型） 必要配件：转头和离心管,（二）.转子(Rotor) 固定角式转子 水平转子 垂直转子 带状转子 连续转子 分析转头,转子的材质： 铝质 较轻,耐受强度较弱,适合在较低 的转速下使用; 不锈钢 耐受强度最好,但材质本身太重； 钛合金 耐受强度不错,重量也比不锈钢轻。,1.水平转子 （1）转子静止时,处在转子中的离心管中 心线与旋转轴平行, （2）转子旋转加速时,离心管中心线由 行位置逐渐过渡到垂直位置,即与旋 转轴成90角, （3）粒子的沉淀方向同旋转半径方向基本 一致有少量的“管壁效应”,水平转子的特点： （1）转子的重心位置较高 （2）样品粒子沉降穿过溶剂层的距离大于 直径 （3）对于多种成分样品分离特别有效 （4）常用于速率区带离心和等密度离心,2.固定角式转子 离心管在离心机中放置的位置与旋转轴心形成一个固定的角度,角度变化在14-40之间。 常见的角度 20 28 34 40,装入溶液的离心管与转轴间的角度是转子制造时形成的，永远不能改变。离心过程中离心管位置不变，样品发生重定向，离心管与转轴间的夹角越小，重定向的程度越打，离心的效率就越高。,角转子的工程过程,a,b,c,d,a制备梯度，装样，把离心管插入转子中； b,离心机加速过程中，梯度和样品层发生重定向（变成径向）； c,颗粒沉降形成区带；d,转子停止过程中，再次定向（变成垂直梯度）,角转子由转子体、转子盖、手提把和测速环等组成，转字体中有离心管孔和底座轴孔。底座轴孔坐在转子驱动轴上，驱动轴的轴头插入其中。 角转子的基本参数包括:可以容纳的离心管数目、最大装样量、最高转速、最大离心半径、最小离心半径、平均离心半径、k系数、最大相对离心加速度、离心管与转轴间的夹角、转子重量以及转子材料等。,角式转子的特点： （1）重心低,转速可较高 （2）样品粒子穿过溶剂层的距离略大于 离心管的直径; （3）“管壁效应” ：,角式转子的特点： （3）“管壁效应” ： 颗粒在角转子中沉降时，沿离心力方向先撞到管壁，然后沿管壁再滑向管底。因此，在试管的一侧就会出现颗粒的沉积，此现象称为壁效应（wall effects）。壁效应容易使沉降颗粒受突然变速而产生对流干扰，尤其在分离沉降特性相似的颗粒时更为明显。,离心管孔的倾角对沉降分离效果的影响很大，角度大，颗粒沉降路径长，分离效果好。角度小，颗粒沉淀距离短，沉淀分离所需时间短，分离效率高。,在使用角转子时应注意，离心管要受到强大离心场的作用，软质离心管（如聚丙烯）在管子没有装满液体的情况下会塌陷。硬质离心管（如聚碳酸脂）反复使用时会破裂。,设40000rpm时 R1最小、 3.8cm R2平均、 5.9cm R3最大、 8.1cm RCF值分别 67,910g 105,400g 144,700g,R1,R2,R3,在离心管的不同部位距旋转中心轴的距离也不同,那么在一定的转速下其RCF值也各不相同,3.垂直转子 离心管垂直插入转子孔内,在离心过程中始终与旋转轴平行,而离心时液层发生90角的变化,从开始的水平方向改成垂直方向,当转子降速时,垂直分布的液层又逐渐趋向水平,待旋转停止后,液面又完全恢复成水平方向。,四、离心管,材料：玻璃（低速）、塑料、不锈钢（高速、超速）,五、离心机使用注意事项,1、离心要平稳 2、平衡 3、低档启动 4、合适的转头和转速 5、干燥清洁 6、按需选用离心管 7、低温离心样品需预冷 8、异常情况，停机检查 9、校正,第三节 常用离心方法及应用,(一).差速离心法 1、原理 利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别,在同一离心条件下,沉降速度不同,通过不断增加相对离心力,使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。 操作过程中一般是在离心后倾倒的办法把上清液与沉淀分开,然后将上清液加高转速离心,分离出第二部分沉淀,如此往复加高转速,逐级分离出所需要的物质。,差速离心的分辨率不高,沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开,常用于其他分离手段之前的粗制品提取。,2.注意点： 可用角式、水平式转头 可用刹车 难以获得高纯度,差速离心法原理示意图,已破碎的细胞 500g,10分钟 沉淀 上清液 (细胞核） 10,000g,10分钟 沉淀 上清液 (细胞膜碎片,线粒体,) 100,000g,3小时 溶酶体 沉淀 上清液 (核糖核蛋白体） (可溶性成份),例：用差速离心法分离已破碎的细胞各组份,（2）密度梯度离心法(又称区带离心法) 该法又分为速率区带离心法和等密度区带离心法。 样品在一定惰性梯度介质中进行离心沉淀或沉降平衡，在一定离心力下把颗粒分配到梯度液中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。该法的优点是：具有很好的分辨率，分离效果好，可一次获得较纯颗粒；适用范围广，既能分离沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。缺点是：离心时间较长；需要制备梯度液；操作严格，不宜掌握。,速率区带离心法 1.原理 是根据分离的粒子在离心力作用下，在梯度液中沉降速度的不同，离心后具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内形成几条分开的样品区带，达到彼此分离的目的。,速率区带离心示意图,临床常使用的分离液是聚蔗糖（Ficoll）、二氧化硅胶体Percoll及蔗糖。把静脉血中单个核细胞分离出来，前一种分离液将血液中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）分为一个层，同时提出。而Percoll分离液将血中淋巴细胞和单核细胞分为二个梯度层，分别提取。后者分离效果优于前者，但操作繁琐。,梯度液在离心过程中以及离心完毕后,取样时起着支持介质和稳定剂的作用,避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。 由于pm则S0, 该离心法的离心时间要严格控制,即有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带,又要控制在任一粒子达到沉淀前。 此法是一种不完全的沉降,沉降受物质本身大小的影响较大,一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。,2.注意点： 严格控制离心时间 pm 事先配成较平缓的连续密度的梯度溶液 不能用角式转头、只能用水平式转头 不能用刹车,等密度离心法 1原理 当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直沿梯度移动到它们密度恰好相等的位置上（即等密度点）形成区带，称为等密度区带离心法。 等密度区带离心的有效分离取决于颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒的大小和形状无关，但后两者决定着达到平衡的速率、时间和区带的宽度。,等密度区带离心示意图,特点： （1）与样品粒子的密度有关 （2）与样品粒子的大小和其他参数无关 （3）转速、温度不变,则延长离心时间也 不能改变这些粒子的成带位置。,2.注意点： 离心时间要长 可用角式转头或水平式转头 粒子密度相近或相等时不宜用 密度梯度溶液中要包含所有粒子密度 不能用刹车,四. 梯度溶液的制备 (一).梯度材料的选择原则: 1、与被分离的生物材料不发生反应。 2、可达到要求的密度范围,且在所要求的密 度范围内,粘度低,渗透压低,离子强度和 pH变化较小。 3、不会对离心设备发生腐蚀作用。 4、容易纯化,价格便宜或容易回收。 5、浓度便于测定,如具有折光率。 6、对于分析超速离心工作来说,它的物理性 质,热力学性质应该是已知的。,常用的梯度材料： .糖类: 蔗糖、甘油、聚蔗糖(Ficoll)、右 旋糖酐、糖原 无机盐类:CsCl(氯化铯)、RbCl(氯化铷)、 NaCl、KBr等 有机碘化物:三碘苯甲酰匍萄糖胺等 硅溶胶: 如Percoll。 蛋白质:如牛血清白蛋白 重水 非水溶性有机物:如氟代碳等,(二).梯度材料的应用范围 1.蔗糖: 水溶性大 性质稳定 渗透压较高 最高密度可达1.33g/ml, 价格低 容易制备, 常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料 有较大的渗透压,不宜用于细胞的分离。,2.聚蔗糖: 商品名Ficoll, 渗透压低 粘度却特别高,为此常与泛影葡胺混合使用 以降低粘度 用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细 胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞,3.氯化铯: 离子性介质 水溶性大 最高密度可达1.91g/ml 重金属盐类,在离心时形成的梯度有较 好的分辨率 被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋 白的分离 价格较贵,4.卤化盐类: KBr和NaCl可用于脂蛋白分离 KI和NaI可用于RNA分离,其分辨率高于铯盐 NaCl梯度 可用于分离脂蛋白 NaI梯度可分离天然或变性的DNA。,5.Percoll: SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮 渗透压低 对生物材料的影响小 颗粒稳定 在冷却和冻融情况下还是稳定的 粘度高 在酸性pH和高离子强度下不稳定 用于细胞、细胞器和病毒的分离,五.分析性超速离心 为了研究生物大分子的沉降特性和结构,而不是专门收集某一特定组分。 它使用了特殊的转子和检测手段,以便连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程。,分析性超速离心的工作原理,椭圆形的转子 一套真空系统 一套光学系统,转子通过一个柔性的轴联接成一个高速的驱动装置,这轴可使转子在旋转时形成自己的轴。转子在一个冷冻的真空腔中旋转，其容纳两个小室：分析室和配衡室。,分析室的容量一般为1ml，呈扇形排列在转子中，其工作原理与一个普通水平转子相同。分析室有上下两个平面的石英窗，离心机中装有的光学系统可保证在整个离心期间都能观察小室中正在沉降的物质，可以通过对紫外光的吸收（如对蛋白质和DNA）或折射率的不同对沉降物进行监测。在分析室中物质沉降时重粒子和轻粒子之间形成的界面就像一个折射的透镜，结果在检测系统的照相底板上产出一个“峰”，由于沉降不断进行，界面向前推进，故“峰”也在移动，从峰移动的速度可以得到物质沉降速度的指标。,在分析室中物质沉降时重粒子和轻粒子之间形成的界面就像一个折射的透镜，结果在检测系统的照相底板上产出一个“峰”，由于沉降不断进行，界面向前推进，故“峰”也在移动，从峰移动的速度可以得到物质沉降速度的指标。,转子容纳二个小室: 分析室 配衡室 ：经过精密加工的金属块,作为分析 室的平衡用。 分析室：容量为1毫升,呈扇形排列在转子中。其有上下二个平面的石英窗,离心机中装有的光学系统可保证在整个离心期间都能观察小室中正在沉降的物质, 通过对紫外光的吸收或折射率的不同对沉降物进行监视。,折射率原理: 当光线通过一个具有不同密度区的透明液时,在这些区带的界面上产生光的折射。 在分析室中物质沉降时重粒子和轻粒子之间形成的界面就象一个折射的透镜,结果在检测系统的照相底板上产生一“峰”。由于沉降不断进行,界面向前推进,故“峰”也在移动,从峰移动的速度可以得到物质沉降速度的指标。,(二).分析性超速离心的应用 1.测定生物大分子的相对分子重量 沉降速度 沉降平衡 接近沉降平衡 沉降速度：超速离心在高速中进行, 使得任意分布的粒子通过溶剂从旋转的中心辐射地向外移动,在清除了粒子的那部分溶剂和尚含有沉降物的那部分溶剂之间形成一个明显的界面,该界面随时间移动而移动,这就是粒子沉降速度的一个指标,然后用照像记录,即可求出粒子的沉降系数。,dx/dt S = 2X RTS M = D(1-) M-该分子不含水的相对分子重量; R-气体常数; T-绝对温度; S-分子的沉降系数; -分子的微分比容(当一克溶质加到一个大体积的溶液中所占有的体积; -溶剂的密度。,2.生物大分子的纯度估计 3.分析生物大分子中的构象变化,六、离心机的应用和维护 （1）离心方法的选择: 选择合适的离心转速和离心时间，就能达到较好的分离效果。 若样品中存在两种以上质量和密度不同的样品颗粒，可采用差速离心法。 对于有密度梯度差异的样品介质，可采用密度梯度离心法。 若不同样品颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内，离心时密度不同的物质颗粒因浮力差异或向下沉降，或向上漂浮，一直移到它们各自密度恰好对应的位置（等密度点），形成区带。可采用等密度梯度离心。 （2）离心时间以及温度和pH值的确定 （3）离心机的使用、维护： （4）离心机常见故障及排除方法：,（1）离心方法的选择: （2）离心时间以及温度和pH值的确定 离心时间：依据离心方法的不同有所差别。差速离心是指某种颗粒完全沉降到离心管底的时间。等密度梯度离心是指颗粒完全到达等密度点的平衡时间。密度梯度离心所需的离心时间则是指形成界限分明的区带的时间。 温度和pH值：为了防止欲分离物质的凝集、变性和失活，除了在离心介质的选择方面加以注意外，还必须控制好温度及介质溶液的pH值等离心条件。离心温度一般控制在4度左右，对于某些热稳定性较好的酶等，也可以在室温下进行。 （3）离心机的使用、维护： （4）离心机常见故障及排除方法：,（1）离心方法的选择: （2）离心时间以及温度和pH值的确定 （3）离心机的使用、维护：各类离心机因其转速高，产生的离心力大，使用不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用离心机时都必须严格遵守操作规程。 （4）离心机常见故障及排除方法：,离心机的应用和维护 （1）离心方法的选择: （2）离心时间以及温度和pH值的确定 （3）离心机的使用、维护： （4）离心机常见故障及排除方法： 电机不转 转头的损坏 机体震动剧烈、响声异常。有许多故障为不正确操作所致，正确操作可减少或消除故障。在工作过程中，如出现任何异常现象均应立即停机，检查原因，不得强行运转，以免产生不必要的损失。,关于制作“棉花”糖的原理：,它的内筒与洗衣机的脱水筒相似，里面加入白砂糖，加热使糖熔化成糖汁。内筒高速旋转，黏稠的糖汁就做离心运动，从内筒壁的小孔飞散出去，成为丝状，到达温度较低的外筒时，迅速冷却凝固，变得纤细雪白，像一团团棉花。,在水平公路上行驶的汽车转弯,三、离心运动的防止：,1、在水平公路上行驶的汽车转弯时,F m,r,2,F,汽车,在水平公路上行驶的汽车，转弯时所需的向心力是由车轮与路面的静摩擦力提供的。如果转弯时速度过大，所需向心力F大于最大静摩擦力Fmax，汽车将做离心运动而造成交通事故。因此，在公路弯道处，车辆行驶不允许超过规定的速度。,阅读离心机使用说明书，转头说明书 说明书应该放置在离心机旁边，使用前必须仔细阅读说明书 防止事故发生,离心机事故,离心机高速运转，使用不当或者维护不当，会出严重事故 主要是转头事故，转头爆炸,离心机的安全使用,说明书与相关资料 机器、转头、离心管正确使用方法 专人管理，维护保养，排出故障,离心基本概念,转速 离心力和相对离心力 容量 K因子,转速的描述,RPM 转/分 角速度每秒转过的弧度数 1 弧度即为弧长等于半径的圆弧所对的圆心角,“ 转速 ” 的含义,离心机的最高转速 转头的最高转速 转头的最高允许转速 转头的允许转速,离心机的最高转速,可以用于该离心机的转头中，转速最高的这个转速，是离心机最高转速,转头的最高转速,转头盖上标明的转速 应注意，同一转头在不同离心机中使用，不一定都能达到转头的最高转速使用,转头的最高允许转速,样品密度不超过1.2克/ml的情况下，和以下因素有关： 离心机型号 离心管形状、材料、厚度 （注意，同样的离心管在不同转头中使用，最高允许转速也可能不同） 离心管帽的材质 离心管是否装满 是否用适配器 必须根据实际使用情况，从转头手册和转头说明书中查询,转头的允许转速,样品密度超过了1.2克/ml的情况下： 转头的允许转速=转头的最高允许转速（1.2/样品的平均密度）1/2 注意：不适用于密度梯度离心,离心力和相对离心力,“离心力是多少个g”的提法不对 离心力=粒子质量离心加速度 （F离心力=mr 2） 相对离心力RCF= F离心力/F重力= r 2/g,RCF与RPM换算, = 2 RPM/60 = 0.10472 RPM RCF= r 2/g=（ 0.10472 RPM ）2r/g r以毫米为单位时， RCF=1.12r（RPM/1000）2 RPM=1000（RCF/1.12r）1/2 例：文献给出条件为80000g， RPM=1000（80000/1.12r）1/2,转头的K系数,什麽是转头的K系数,K系数是转头的一个特性指标，它的大小可以衡量转头离心效率的高低.,转头的K值可以查表得到,K 系数的计算,R max: 转头的最大半径. R min 转头的最小半径. RPM: 转头的转速,在离心时，估算沉降时间 t ：离心时间（小时）。 K ：实际转速下的转头K值。 S ：粒子的沉降系数。,K系数的应用,从一个转头换成另一个转头时估算沉降时间. (即根据文献资料,使用现有的转头,建立实验条件) 利用已知转头的实验条件,使用另一个转头,分离相同样品时,如何确定实验条件。,K值的应用,K值的应用,同一转头，改变离心转速时，计算离心时间：,K值的应用