肿瘤免疫及其免疫检测瑞金医院检验科顾志冬.ppt

肿瘤免疫 及其免疫检测 瑞金医院检验科 顾志冬,什么是肿瘤？为什么会发生肿瘤？,肿瘤是正常组织异常增生所形成的赘生物。按其所引起的后果不同可分为恶性和良性两种。,第一节 概述,实践表明，内在的遗传因素、免疫状态和外部的诱变因子，是构成肿瘤发生发展的基础和条件。 其中，机体的免疫状态，尤其是细胞免疫功能的强弱，已被视为是否发生肿瘤的重要内在因素。,肿瘤发病率和死亡率,WHO：每年肿瘤死亡人数为630万，至2020年， 全世界肿瘤患者将达1500万。 我国：恶性肿瘤死亡率为108.39/10万，占死亡 人数17.94%，居死亡原因第二位。 肿瘤的早期发现和早期治疗可明显提高患者生 存率。,最普遍的恶性肿瘤死亡原因,临床：病史、体症,物理检查：X光、CT、磁共振、B超、红外、 核医学,术前：穿刺、刮片、拉网 术后：组织切片,免疫：肿瘤抗原和代谢物测定,分子生物：肿瘤相关基因分析,肿 瘤 诊 断,辅助,病理,正常 间变 恶性 可见前期 不可见前期,物质分析,影像诊断,肿瘤的发展及诊断期,肿瘤的免疫逃避机制？,肿瘤细胞缺乏有效的抗原性表位，难以触发足够的抗肿瘤免疫效应。 肿瘤细胞的MHC分子表达发生改变，异常表达的MHC分子，有碍机体免疫细胞对肿瘤细胞的识别，影响抗原递呈作用。 不能正常表达B7等活化免疫细胞的共刺激分子和黏附分子。 患者血清中存在着封闭因子。 肿瘤细胞产生的某些细胞因子对T细胞的产生有抑制作用。 肿瘤细胞表达FasL，和活化CTL的Fas结合，介导CTL凋亡。,第一节 概述,体液免疫效应,激活补体的溶细胞作用 介导杀伤细胞的细胞毒作用 调理吞噬作用 干扰肿瘤细胞的生物学行为 其他作用,第二节 机体的抗肿瘤免疫效应机制,细胞免疫效应,T细胞 生物学效应包括T细胞的直接杀伤和对免疫系统其它成分的活化。 （1）CD4阳性的辅助T细胞 （2）CD8阳性的细胞毒T细胞,第二节 机体的抗肿瘤免疫效应机制,CD4阳性的辅助T细胞 在胸腺中分为Th1和Th2，其中和肿瘤免疫关系密切的是Th1细 胞。 激活：肿瘤细胞抗原+抗原递呈细胞（树突状细胞）+MHC II类分子形成复合物，被CD4阳性的T细胞的TCR识别并使自身活化。 效应：通过释放细胞因子（TNF，IFN-）发挥抗肿瘤作用。 Th表面的CD154分子和APC表面的CD40分子结合，释放IL-12。促进CTL分化和增殖。 Th和APC释放共刺激信号分子，协助CTL的分化和增殖。 可增强B细胞活化引起的抗体应答及CD8阳性CTL的细胞毒 其亚群可分泌因子促进体液免疫应答。,第二节 机体的抗肿瘤免疫效应机制,CD8阳性的细胞毒T细胞 是肿瘤免疫的主要途径。 通过释放毒性物质或促发靶细胞上的死亡受体，而直接溶解靶细胞，或通过分泌IFN- 间接杀伤肿瘤细胞，在机体发挥免疫监视的作用。,第二节 机体的抗肿瘤免疫效应机制,细胞免疫效应,NK细胞 NK细胞是宿主固有免疫或一线防御机制的一部分，非MHC限制性，她们不需要对宿主或其免疫功能进行调整适应。对肿瘤细胞和病毒感染细胞比对大多数正常细胞更具有毒性作用。其作用机制类似于CTL，还可分泌大量的细胞因子以调节机体免疫反应。 新发现的NKT细胞在胸腺外发育，其发育依赖于TCR与类MHC I类分子CD1的相互作用，经TCR触发，主要介导NK类细胞毒活性。,第二节 机体的抗肿瘤免疫效应机制,细胞免疫效应,巨噬细胞 活化的巨噬细胞与肿瘤细胞的结合可触发细胞毒活性，细胞毒性介质有细胞溶解蛋白酶、TNF-及其相关的因子、IFN- 和IFN-、IL-1，氧化反应的中介物如过氧化氢，氮化反应的中介物如NO、精氨酸酶等也可能属于此列。 它是参与抗肿瘤、抗感染的主要效应细胞。,第二节 机体的抗肿瘤免疫效应机制,细胞免疫效应,树突状细胞 是一类专职抗原递呈细胞，辅佐T、B细胞参与特异性杀伤肿瘤的过程。 可利用制备肿瘤特异性树突状细胞以进行肿瘤的生物疗法。,第二节 机体的抗肿瘤免疫效应机制,肿瘤抗原是细胞癌变过程中所表达的新生物或过量表达产物，它的产生与下列因素有关： 细胞发生转化而产生新的蛋白 点突变或基因重组致细胞内癌基因活化，促使表型 改变 随机病变而产生新的蛋白 胚胎抗原的过度表达或分化抗原的异常表达。,第三节 肿瘤抗原的分类,肿瘤特异性抗原 为肿瘤细胞所特有，只表达于肿瘤细胞，而不存在于任何处于不同发育阶段的正常细胞。 1.化学物质诱发 其抗原的显著特征是高度个体化，即高度的个体特异性。不同肿瘤，甚至同一化学致癌物诱导的肿瘤，所表达的肿瘤抗原可有不同，而不同化学物质引起的肿瘤，其抗原的差异性更大。,第三节 肿瘤抗原的分类,肿瘤特异性抗原 2.病毒诱发 无严格的特异性，通常由同一种病毒诱发的所有肿瘤，都具有相同的TSA。血清学试验和肿瘤特异性CTL的检测，均有助于抗原的检定。其可诱导机体的免疫应答，故又被称为肿瘤特异性移植抗原。其成分多系病毒基因的表达成分。,第三节 肿瘤抗原的分类,肿瘤特异性抗原 3.自发 自发肿瘤系无明显诱因的肿瘤，很难检测到特异性的抗原标志物，其原因可能有： 早期肿瘤细胞及近亲本子代细胞一定时间内可以表达，但后代细胞因为染色体的随机突变而失去表达。 可能存在，但单独使用抗原抗体方法难以得到确定答案。,第三节 肿瘤抗原的分类,肿瘤相关抗原 指非肿瘤细胞所特有的抗原成分，也少量存在于正常细胞，但在肿瘤发生的机体可异常表达，可分为胚胎性抗原和分化抗原两种类型。 胚胎抗原 分化抗原,第三节 肿瘤抗原的分类,第四节 常见肿瘤的免疫诊断及应用原则,一、肿瘤标志物的检测及临床意义,肿瘤标志物,是显示肿瘤存在的生物化学指示物 与肿瘤相伴产生 抗原或激素或酶蛋白 存在于血液、体液及组织中 可定量或定性检测到 可以作为辨认和追踪肿瘤存在和发展的标志,肿瘤标志物研究历史,1845 Bence-Jones 本周蛋白 1930 Zondek HCG 1959 Markert 同工酶 1963 Abelev AFP 1965 Gold & Freeman CEA 1969 Hubner & Todaro 癌基因 1975 Kohler & Milstein 单克隆抗体 1978 Herberman 提出肿瘤标志物概念 1979 英国第7届肿瘤发生生物学和医学会议 肿瘤标志物被确认并应用临床 1980 Koprowski CA19-9 1981 Bast et al CA125 1981 Colcher et al CA72-4 1984 Kufe et al CA15-3 .,已建立的肿瘤标志物,肿瘤标志物的分类,细胞肿瘤标志物：位于细胞中的物质或抗原，如激素受体、白血病表型。 体液肿瘤标志物：病理情况下，浓度增加时可在血液、尿液或其他体液中测得的物质，如AFP、CA19-9、 CEA、 CA15-3等。 肿瘤表型标志物：酶、胚胎性抗原、异位性蛋白、激素等。出现于癌细胞转化和临床进展阶段。 肿瘤基因标志物：基因突变、基因表达异常等，出现于癌前起动阶段。,在各种肝病中AFP的变化,AFP在各类肝病中的阳性率,AFP阳性后查找肝癌,肿瘤直径 五年生存率 5 cm 31.25% 10cm 3.7%,癌胚抗原,一. 正常值 (直接法 ng/mL),胸，腹水 10ng/mL,二. 病理值 (直接法 ng/mL),一) 病种： 阳性检出率 (Ca) 1. 胰、胆 肠、胃 泌尿、乳房 6080% 5060% 2030%,胰、胆、肠、胃、肺炎症等良性病变一般不 25 ng/mL,癌胚抗原,二. 病理值 (直接法 ng/mL),2. 胸腹水阳性率高于血液 3. AFP，CEA联合检测鉴别原发/继发肝癌,总PSA和游离PSA,PSA的两种主要形式,游离PSA,结合PSA (PSA-ACT) -1-antichymotrypsin,抗原结合部位,PSA,PSA,ACT,PSA的检测,PSA66MAb,PSA10 MAb,35%,30%,25%,20%,15%,10%,5%,0%,良性疾病的可能性增加,前列腺癌的可能性增加,FREE PSA % 结果解释,前 列 腺 癌 的 可 能 性 %,CI* Confidence Interval,糖类抗原12-5（CA125） 是卵巢癌和子宫内膜癌的肿瘤标志物 分子量为20万的糖蛋白 可被单克隆抗体OC125所识别 在卵巢肿瘤上皮和Mullerian副肾管来 源的病理和正常组织中表达，其生物 学功能不明。,糖类抗原12-5（CA125）,正常人血清中CA125的临界值为35U/ml CA125的半衰期仅4.8天，在血中很快代谢，所测即时结果能反映肿瘤近期的变化状态,CA125在卵巢癌，尤其是上皮性卵巢 癌、子宫内膜癌可出现升高，还可在 肺癌、宫颈癌等肿瘤状态时升高。 CA125在子宫内膜异位症、1%的健 康妇女、3%的患良性卵巢疾病妇女 及其他非肿瘤患者也可见到升高。,CA125的临床应用,卵巢癌的辅助诊断 观察病情及预测预后 -血清CA125升高（或降低）2倍的患者 中大于80%的病例为病情进展（或消退） -CA12535U/ml的病人中有95%在第二次 手术时仍有肿瘤存在,早期复发的监测 75%的患者在肿瘤复发前一年左右时间CA125的水平就已升高,CA125的临床应用,CA125升高：90%的卵巢癌和期 50%的期和90%的期 CA125升高水平与肿瘤大小和分期有关 CA125可以区别可触及的良性或恶性实体瘤,CA125的临床应用,卵巢癌和良性卵巢疾病的鉴别诊断 连续测定CA125 联合检测CA199可提高准确性，敏感性可从83.3%提高到91.6% 卵巢上皮性癌患者CA125明显高于对照组，敏感性可达82%到93.5% 8%的良性患者CA125大于65U/ml，而恶性患者占75%,CA125的临床意义,术后 CA125 的升高是癌肿复发的重要标志， 当CA125大于65U/ml时则不需作第二次手术探查,CA125的临床应用,糖类抗原19-9（CA199） CA19-9是胰腺、胃和肠癌的标记物。 正常人群血清CA19-9阳性的临界值为 37U/ml,癌组织中的浓度要高于正常组织或 炎性组织；是胰腺癌诊断较好的指 标，还可用于胃肠癌的检测和筛选。 伴有黄疸的良性疾病患者也可出现 CA19-9升高，但一般不120/ml， 经临床处理后可恢复到正常值范围。,CA19-9的临床应用,诊断 -可以作为胰腺和胆管癌较好的标志物用于临床，胰腺癌的阳性率可达70%92%，胆管癌为66.7% -对胃癌、肝癌和结直肠癌的阳性率分别可达25%60%、56%60%，18%58%,疗效监测 治疗中及术后含量下降乃至正常表示治疗方案正确 复发跟踪 升高可作为肿瘤复发转移的亚临床诊断或重要的辅助诊断指标,CA19-9水平在胰腺癌诊断中反应参数的比较,神经原特异性烯醇化酶（NSE）,同功酶类肿瘤标志物，正常仅存于神 经组织和红细胞中 正常人血清值为 13g/L 小细胞肺癌、神经母细胞瘤和神经内 分泌肿瘤及脑损伤时升高 待测标本绝对禁止溶血，溶血可出现 NSE血清水平升高,NSE的临床意义,NSE在小细胞肺癌中的阳性率明显高于对照组，NSE可作为小细胞肺癌的高特异、高灵敏的肿瘤标志物,跟踪监测癌肿病情进展和疗效判断 -肺癌 NSE高于11.8 g/L预示肺癌患者生存 期较短 化疗24小时后 NSE下降是治疗效果良 好的标志,其他癌症 癌症复发的早期标志，尤其是存在胸腔、肝、骨骼、脑、脊髓转移 NSE升高的癌症患者5年存活率仅为5%12%,NSE的临床应用,肿瘤标志物对分型的比较,阳性率,Ebert, W., et al. Anticancer Research, 1996,16:2161-2168,人绒毛膜促性腺激素（HCG）,糖蛋白类激素，由蛋白核心与位于 羧基端的以唾液酸为终止的侧链组成 两个亚基组成: & : 与 - LH, TSH 和 FSH相同 :与-LH有交叉 由合胞体滋养层细胞产生 被证实是一种原始物质 (可作为一种有用的肿瘤标志物),hCG Epitopes,Intact hCG,Free ,Free ,Free -hCG Assay,Catching Antibody,Detecting Antibody,HCG,临床应用： HCG上升：几乎所有绒毛膜上皮细胞 癌、70%的非精原细胞性睾丸癌，胃 肠道、肺、 乳腺肿瘤时亦可见 HCG水平与肿瘤大小、疾病预后有关 脑脊液中HCG上升提示肿瘤有脑转移 可用于监测治疗,第四节 常见肿瘤的免疫诊断及应用原则,二、常见肿瘤标志物检测的免疫方法,标记免疫方法,HAPATITIS,CANCER,FERTILITY,PROTEINS,TDMs/DRUGS,TYROID, ANEMIA,HBV HCV,M 107,10,10-15,10-4 g/L,AFP FER CEA CA199,PRL HCG LH FSH GH Myoglobin,RHF IgG C3 ASO CER TRF AAG,QUI GEN AMI PHY,FT3 FT4 Dig T3 T4 TSH Prog,Immunoassay Analyte Map,待测物质浓度与检测手段,临床化学分析,pg/mL,ng/mL,mg/mL,mg/mL,g/L,免疫分析,Therapeutic Drugs,Thyroid Hormone,Fertility Hormone,Allergy,Cancer Markers,Infectious Disease,Vitamins,Serum Proteins,第四节 常见肿瘤的免疫诊断及应用原则,三、肿瘤标志物的应用价值,肿瘤标志物的应用价值,普查 定位 辅助诊断 分期 疗效监测 预后 预测,普查,一般不适宜对无症状人群进行普查 CEA查结肠癌 普查 在消化病房使用,发病率 370/10万 10000/10万 灵敏度 95% 95% 特异性 70% 70% 真阳性数 370*95%=351.5 10000*95%=9500 假阴性数 370-351.5=18.5 10000-9500=500 真阴性数 99648.5*70%=69753.95 90000*70%=63000 假阳性数 99648.5-69753.95=29894.55 90000-63000=27000 阳性预示值 0.15% 26.03% 阴性预示值 99.97% 99.22%,肿瘤标志物普查五项原则,应十分清楚该肿瘤的发病率 该肿瘤标志物应能检测早期肿瘤 该肿瘤的早期治疗比晚期治疗更经济有效 测定方法的灵敏度、特异性和重复性良好 普查所需费用能被接受,定 位,肿瘤标志物基本上不能对肿瘤定位。 极少数肿瘤标志物如PSA，PAP，甲状腺球蛋白具器官特异性，但不具肿瘤特异性。,确 诊,通常不能进行确诊。 因为肿瘤标志物无足够的灵敏度，不能 排除假阴性结果。 本周蛋白(多发性骨髓瘤）、AFP（肝 癌）、-HCG（绒毛膜癌）和降钙素 （甲状腺C-细胞癌）等有助确诊。,分 期,大多数肿瘤标志物与疾病分期有关，且浓度与肿瘤大小通常存在关联。 但并不能根据个体测得值来判断肿瘤大小， 也不能以肿瘤标志物浓度精确指示各期肿 瘤，因为各期肿瘤的肿瘤标志物浓度范围 极广，且互相重叠。,肿瘤标志物评价治疗有效性方案(Beastall,1991),无效：浓度与治疗前相比下降50% 有效：浓度与治疗前相比下降90%,预 后,术前浓度增高，术后降低，表示这些肿瘤标志物对此肿瘤有预后价值。 在病程监测过程中，肿瘤标志物的浓度增高或降低与疾病的预后密切相关。,术后肿瘤标志物水平的变化,73,肿瘤标志物水平,跟 踪 复 发,预 测,利用ROC曲线进行 PPV：阳性时患肿瘤的可能性 NPV：阴性时不患肿瘤的可能性 PPV和NPV与灵敏度、特异性和患病率有关 肿瘤标志物的灵敏度、特异性、PPV、NPV 不是固定不变的，而是依赖于选定的临界值。,肿瘤标志物的临床应用,1. 预后：病员分群 ( - )非保护人群 ( + )保护人群-预后好、坏,2. 疗效观察：外科：手术切除/残留/姑息 保守：药效、放疗效果 3. 随访： 术后6周 三年 五年 七年 4. 良/恶鉴别：辅助指标,标志物,三月一次,半年一次,一年一次,肿瘤标志物的应用原则,1. 有关标志物联合检测 - 提高灵敏度 2. 阳性标志物动态观察 - 提高准确性 不应以单项、单次检测下诊断,肿瘤标志物的其它几个问题,正常参考范围的界定 方法学不同而导致的结果的不统一,肿瘤标志物的正常参考范围,目前通常以正常人群的95%的可信区间为正常参考范围，对于肿瘤标志物，由于双侧通常是无意义的，因此一般取右单侧 95%为正常参考范围。即有5%的正常人在检测时其值会超过正常参考范围，引起临床的假阳性结果。,正常参考范围的建立 正常人群的平均值2SD,2.5,97.5,肿瘤标志物的正常参考范围,研究表明，正常参考范围对于肿瘤标志物来讲是毫无意义的，我们希望通过检测值来了解： （1）阳性结果提示该病人罹患肿瘤的概率 （2）阴性结果提示该病人不罹患肿瘤的概率,最后通过概率的大小来指导临床应该 进行的检查和处理措施，因此应用ROC曲 线（receiver operator characteristic curve)来 确定最佳界定值（cutoff value）。,临 界 值 的 确定,根据金标准确定病人和对照两组例数相似的人群，并测出各组的实验数据。 用该实验数据的不同域值区分阳性和阴性的不同分界点，分别计算灵敏度和特异性。