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文档简介
转基因黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因的克隆及表达,制片:何颖 舒冬梅 王惜 韩可以,操作目的:,采用RT-PCR技术,从黑曲霉的菌丝体RNA中扩散出葡萄糖淀粉酶GAT的结构基因,将其转接到pPIC9载体中,转入巴斯德毕赤酵母GS115中,获得重组酵母,使重组酵母中的葡萄糖淀粉酶活增高。,基因载体:pPIC9,操作方法: 1.引物设计,根据已知的黑曲霉葡萄糖淀粉酶一基因序列和表达载体,pPIC9的克隆位点,利用DNAsis设计一对扩增葡萄糖淀粉酶一基因的引物,上游引物为5 -TACGTAGCGACCTTGGATTCATGGTT - - 3,带有SnaB一位点;下游引物为5 -GCGGCCGCACTATAGCGAAATGGATTGAG - 3,带有Not一位点。,RT-PCR扩增:,首先,黑曲霉保藏菌种经查氏斜面培养基活化后,接种于100ml灭菌的黑曲霉液体发酵培养基中,加少量玻璃珠,200r/min、30,培养6670h,以其为实验材料,利用总RNA提取试剂合提取黑霉的总RNA。再用RNA为模板,以下游引物进行反转录,获得cDNA第一条链。65热变性5min,冰浴,然后加入反转录酶,置于PCR仪中,3010min,421h,942min。,再以反转录产物为底物,PCR扩增目的基 因,反应条件为943min热变性; 9430s,5450s,722min,40个循环;,72延伸10min。 反应结束后,经琼脂糖凝胶电泳,用DNA凝胶试剂盒回收大约1.9kb的片段。将回收产物连接到pGEM-T载体上,转化DH5a感受态菌,利用互补法进行阳性克隆的初步筛选。,表达载体的构建:,筛选重组子的示意图,C 转化子的筛选和鉴定(检),基因工程的操作过程,由于重组率和转化率不可能达到理想极限,因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非
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