质粒DNA的提取和鉴定.ppt

第一部分 碱裂解法提取质粒,一、实验目的,通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒。,提纯的思路,质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA 要去除的物质： 蛋白 基因组DNA 脂类及小分子杂质 RNA,二、实验原理,碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性pH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。 碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）,三、实验仪器、材料与试剂,（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅 （二）材料：含有质粒的大肠杆菌、LB液体培养基 （三）试剂： 溶液I 50mM 葡萄糖 25mMTrisHCl（pH8.0）10mM EDTA 作用:分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 溶液II 0.2N NaOH 1%SDS（新鲜配制） 作用:细胞壁肽聚糖碱性下水解,核酸和蛋白质变性。 溶液III 5M KAC 作用:酸性下质粒DNA复性，变性蛋白SDS线性DNA沉淀， K可中和DNA,平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫） 注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。 无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀 TE缓冲液：溶解DNA,三、实验仪器、材料与试剂,1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4下12000g离心30秒。 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于100l溶液中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。 4、加入新配制的200l溶液, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。 5、加入150l预冷的溶液,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4下12000g离心5-10分钟。,四、操作步骤,四、操作步骤,6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4下12000g离心5分钟。 7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20冰箱中20分钟，然后4下12000g离心10分钟。 8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70乙醇洗沉淀一次,4下12000g离心5-10分钟。 9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。 10、将沉淀溶于20l TE缓冲液(pH8.0，含20g /ml RNaseA)中，储于-20冰箱中。,碱裂解法流程图,对数期菌体,溶液III中和,溶液I充分重悬,溶液II裂解,上清液,抽提,离心洗涤,酒精沉淀,干燥溶解,沉淀,质粒DNA溶液,五、注意事项材料准备,使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加） 培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失 尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量 菌株不要频繁转接（质粒丢失）,五、注意事项细胞裂解,菌体量适当。 培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。 变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断。 复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染。 G菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁。,五、注意事项核酸分离、纯化,采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,五、注意事项核酸沉淀、溶解,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解,菌体老化 碱裂解不充分 菌体中无质粒 溶液使用不当,请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养 可减少菌体用量或增加溶液的用量 不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。 溶液在温度较低时可能出现浑浊，置于37保温片刻直至溶解为清亮的溶液。,六、质粒DNA提取常见问题,问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？,原因,对 策,混有蛋白 混有RNA 混有基因组DNA,不要使用过多菌体。重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质 加入RNaseA室温放置一段时间 加入溶液II 和III后防止剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。,六、质粒DNA提取