超氧化物歧化酶(SOD)活性测定.ppt

超氧化物歧化酶(SOD) 活性测定,(NBT法),一、测定意义 二、目的要求 三、原理 四、仪器设备 五、试剂配制 六、植物材料 七、操作步骤 八、结果计算 九、注意事项 十、思考题,一、意义：,细胞内自由基的产生和消除处于动态平衡状态，自由基水平很低，不会伤害细胞。,植物正常情况下,植物逆境胁迫下,O-.2、H2O2、OH的产量增加； SOD、CAT、POD活性降低； VtE、VtC、CAR、GSH含量降低； 从而伤害细胞。,植物体内活性氧代谢系统的平衡被打破,什么叫逆境？,逆境是指对植物生存生长不利的各种环境因素的总称.,逆境的种类?,为什么要测定完全液和缺素苗的SOD活性？,二、目的要求：,1.了解SOD活力测定的实践意义； 2.掌握SOD测定的原理及操作要点； 3.比较完全液溶液和缺素溶液培养的 玉米苗叶片SOD活性的差异。,三、原理：,三、原理：,依据SOD能抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2.-，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2.-，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。,四、仪器设备,研钵；玻璃试管; 40W荧光灯; 移液管等。,五、试剂配制,1、提取介质50mmol/L(pH7.0)磷酸缓冲液。 2、反应介质50mmol/L(pH7.8)磷酸缓冲液, 内含77.12mol/L硝基四唑蓝, 0.1mmol/L EDTA, 13.37mmol/L蛋氨酸。 3、80.2mol/L核黄素溶液: 用含有0.1mmol/L EDTA的50mmol/L(pH7.8)的磷酸缓冲液配制。 SOD反应混合液,3.9ml反应介质,0.1ml 80.2mol/L核黄素溶液,六、植物材料:,玉米叶片: 完全液培养苗 缺素液培养苗,七、操作步骤,将玉米叶片剪细 混合均匀称0.2g (用保鲜膜包好放低温 冰箱预冻),研磨成匀浆再加入3ml缓冲液,研磨均匀后, 将匀浆液倒入聚乙烯离心管中低温(04)下、4800rpm离心10min上清液即为酶液，将上清液倒入小青霉瓶，低温下贮存，供SOD活性测定。,1、酶液的提取：,加入2ml冰冷的 0.05mol/LpH7.0 磷酸缓冲液及少量的石英砂,研钵, 2.SOD活性测定： 取6支试管, 编号, 按下表加入试剂。将1号管用黑纸袋套上, 与其它试管一起放荧光灯下, 光强3000Lx照光10min, 到时间后关灯, 用黑布罩上试管(如室内光线不强, 不罩黑布也可), 以1号试管溶液为参比, 测定样品在560nm处的吸光度。不加酶的2号试管溶液颜色最深; 加入酶的由于SOD抑制了硝基四唑蓝的光还原,颜色变浅。,2、活性测定： 取6支干燥的、玻璃质量一致的普通试管，按下表顺序加入试剂,式中：Ack为2号对照管溶液在560nm处的吸光度值; AE为样品测定管溶液在560nm处的吸光值; V为酶液总体积（ml)； W为提取酶液的植物材料的鲜重（g)； Vt为测定时酶液的用量(ml)。,八、结果计算：,（Ack-AE)V SOD活性(U/g鲜重) AckWVt50,一个酶活单位定义为将硝基四唑蓝的还原抑制到对照一半(50)时所需的酶量。,九、注意事项: 1.所用试管的玻璃质量要一样。包括厚度、直径、质量等。 2.照光条件要一致。照光时试管放的高度、背景等。 3.要多做对照消除日光灯管的光质差异。 4. 植物组织中的酚类物质对测定有干扰，对酚类含量高的材料提取酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮消除。 5.结果计算时要用相邻对照管代入公式计算。,十、思考题: 1.在SOD活性测定中为什么设照光和暗中两个对照管。 2.影响本实验准确性的主要因素是什么？应如何克服？,1.下次实验：改良半叶法测定植物光合速率 2. 请按植物生理生化实验B补充材料认真书写预习报告！ 3. 实