[精品论文]2-甲基环己醇在 HIV-1 蛋白酶表面附着位点.doc

精品论文2-甲基环己醇在 hiv-1 蛋白酶表面附着位点的模拟研究王加磊，孟现美，张庆刚，张怿慈，张少龙5（山东师范大学物理与电子科学学院，山东 济南 250014） 摘要：本研究采用 amber ff12sb 力场对 hiv-1 蛋白酶活性位抑制剂体系和异位抑制剂体系 分别进行了 200 纳秒的分子动力学模拟,发现了 2-甲基环己醇除 exo 位外的新结合位,分析 了它们的结合过程,用 mm-pbsa 方法分别计算不同结合情况下两体系活性位点抑制剂 tl-310与 hiv-1 蛋白酶的结合自由能。2-甲基环己醇的羟基和附着位点残基形成氢键,其甲基环己 基和附着位点残基形成疏水性结合。这些分析结果有助于了解 hiv-1 蛋白酶表面附着位点的 性质,为筛选开发异位抑制剂提供了参考。关键词：计算化学;hiv-1 蛋白酶;2-甲基环己醇;mm-pbsa;amber ff12sb 力场;中图分类号：o641.1215simulation research of 2-methylcyclohexanolattachmentsites on hiv-1 protease surfacewang jialei, meng xianmei, zhang qinggang, zhang yici, zhang shaolong20(college of physics and electronics, shandong normal university,jinan shandong 250014) abstract: in this study,we performed 200 nanosecond long molecular dynamics simulation for the allosteric inhibitor system and active site inhibitor system of hiv-1 protease respectively usingamber ff12sb force field.we found another binding site except for exo-site of 2 - methylcyclohexanol,and analyzed the binding process,and both systems bind free energy of25active site inhibitor tl-3 with hiv-1 protease were calculated using mm-pbsa method indifferent binding conditions.2 - methylcyclohexanol hydroxyl group and attachment site exists hydrogen bonds,the methylcyclohexyl group and the attachment site also exits hydrophobic interaction.these results might help to understand the nature of the attachment site on hiv-1 protease surface,and provide a reference for the screening and development of hiv-1 allosteric30inhibitors.key words: computational chemistry;hiv-1 protease;2-methylcyclohexanol;mm-pbsa;amber ff12sb force field0研究背景35人类免疫缺陷病毒(hiv)是一种感染人类免疫系统的病毒,属于逆转录病毒科慢病毒属, 其潜伏期较长。hiv 分为 hiv-1 与 hiv-2,hiv-1 致病力强,世界范围内的艾滋病流行主要是 由 hiv-1 造成的,90%多的 hiv-1 感染者会在 1012 年内发展成为艾滋病。hiv-2 主要分布 在非洲西部,其感染往往没有相关的病症。目前,人类已经针对 hiv-1 开发了一系列药物,它们是针对艾滋病毒复制过程中所需酶设40计的,其中针对 hiv-1 蛋白酶(hiv-i protease)设计的药物在艾滋病治疗过程中起到重要的作 用,这类蛋白酶抑制剂作为高效抗逆转录病毒疗法(haart,俗称鸡尾酒疗法)的重要组成部基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金(20093704110001);国家自然科学基金(11274206);山东省自然 科学基金(zr2011hm048)作者简介：王加磊(1986-),男,硕士研究生,主要从事分子动力学模拟研究通信联系人：张少龙(1963-),男,副教授,分子动力学. e-mail: - 11 -分为延长艾滋病人的生命发挥了不可替代的作用1。目前蛋白酶药物都是以活性位(active site)为靶点进行抑制的,然而 hiv-1 已经对此类抑制剂进化出了耐药性,美国多于 10%的新艾滋病例是由病毒的耐药株引起的2。因此设计新机制的蛋白酶抑制剂已迫在眉睫。45hiv-1 蛋白酶是一种逆转录天冬氨酸蛋白酶,它有天冬氨酰基蛋白酶共有的 dtg 活性序 列。hiv-1 蛋白酶的 x 射线衍射晶体结构显示它是由两条包含 99 个氨基酸的多肽链形成的 一个 c2 对称的同质二聚体3。活性部位由 asp25/25-thr26/26- gly27/27序列组成,asp25/25 在催化作用中发挥关键性的作用。活性部位上面是挡板区 结构(flap),它把活性部位遮盖起 来。flap 对底物或抑制剂的进出起门户作用,当 flap 打开时,底物进入蛋白酶内部并与活性位50结合,flap 关闭后,底物与活性部位发生相互作用,当底物加工处理完毕后 flap 再次打开,加工成 熟的蛋白会被释放出去,然后新的底物进入并开始新的加工周期。因此,flap 的形态在病毒蛋 白加工过程中会发生很大的变化4。通常,活性位抑制剂与活性位点结合后底物会无法进入蛋白酶接受加工,这样该蛋白酶便 失去作用,但病毒耐药株削弱了活性位抑制剂与活性位的结合程度,降低了治疗效果。scripps55研究所的 a. perryman 等人用片段筛选的方法发现了活性位点之外的新结合位点(allosteric binding sites,异位结合位点)-exo 位和 outside/top of flap 位(图 1 所示),并发现了结合在这两个 异位结合位点上的两种化合物,2-甲基环己醇(4dx)和 6-吲哚甲酸3。它们虽然尚未表现出抑 制作用,但可以成为开发耐药株新型抑制剂的出发点,沿此路线设计的新药有望减慢病毒耐药 性进化,增强现有疗法的疗效。60图 1 hiv-1 蛋白酶结构fig.1 the structure of hiv-i protease1理论方法65分子动力学模拟广泛用于获取蛋白质等生物大分子的结构随时间演化的信息,再通过统 计计算可得到体系的动力学热力学物理量。但它受到不准确势能函数(力场问题)和有限模拟时间(采样问题)两个主要缺点限制。力场的改进工作虽然集中在极化力场,但它比固定电荷力场更耗时,最近研究表明,非极 化力场仍有改进余地。amber ff12sb 是目前最新的非极化力场,对于蛋白质而言,它是在70amber ff99sb 基础上加入新的主链和侧链扭转势,改进后的新的主链骨架扭转势更精确,与实 验数据符合得比较好,侧链的改进是通过拟合更精确量子从头算数据,这使侧链两面角扭转势 更精确5。本研究使用 amber ff12sb 力场得到了更精确的结果。mm-pbsa(molecular mechanics poisson-boltzmann surface area)是计算溶液环境中溶质 分子结合自由能的方法。mm 代表分子力学,pb 代表用 pb 隐形溶剂模型求解体系极化溶剂75效应,sa 代表用溶剂可接触表面积来经验求解非极化溶剂效应6。受体和配体的结合自由能 公式为：dgb i n d i=n ggc o m p -l egx l i g a n-dgr e c e p t o rmm-pbsa 把各类(complex,ligand,receptor)的自由能分解成气相能量焓,溶解自由能和熵 项7：g = eg a s+ es o l -v t s80= eb a +tev d w+ ec o u+l gs o ,l pv o l a+rgs o ,lnvo n p o-l ta r s其中 ebat 为力场中成键项中的键,角和扭转角项的总和,evaw 和 ecoul 为非成键项中的范德 华能和静电相互作用能,gsolv,polar 为溶解自由能的极化项,gsolv,nonpolar 为溶解自由能的非极化项 8。ebat、evaw、ecoul 之和为完整的气相力场能,即 mm 部分。溶解自由能极化项 gsolv,polar 可通过隐形溶剂模型中的 pb 方程求解,溶解自由能非极化项85gsolv,nonpolar 通常经验得通过溶剂可接触表面积(solvent-accessible surface,sasa)的线性关系式 求解：gs o ,lnvo n p o =l agr s a s +a c o n s t另外,溶解自由能非极化项在更精确方法下可再次分解为排斥项和吸引项9。90951002计算过程分子动力学模拟使用软件包 amber12 和 ambertools12。初始构象取自蛋白质库(pdb id:3kf0),pdb 中包含 hiv-1 pr、tl-3、4dx、dmso 和 bme，其中二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，dmso)和 -巯基乙醇(beta-mercaptoethano，bme)在 hiv-1 蛋白酶的表达、提纯 和结晶中作为有机溶剂起溶解和稀释作用3, 在本研究中予以忽略; 提取 pdb 中 hiv-1pr+tl-3+4dx 作为异位抑制剂体系,提取 hiv-1 pr+tl-3 作为活性位抑制剂体系;由于结晶 水在 hiv-1 蛋白酶与抑制剂的结合中起了非常重要的作用10,pdb 中的结晶水予以保留。将 得到的结构在 ambertools12 的 leap 模块中补全缺失的氢原子并添加 ff12sb 力场参数。抑 制剂 tl-3 和分子片段 4dx 的部分电荷用 sqm 模块中的 am1-bcc 方法计算。两个体系周 围加有 9 个氯离子以保持体系中性。使用 shake 算法进行键约束计算11。将两个体系质心 置于截角八面体盒子中心,盒子外壁至溶质分子的距离为 10 ,盒子中加入水分子,水分子采 用 tip3p 模型。接着采用 amber12 的 pmemd 模块对两个体系进行能量最小化12,能量最小 化先是采用 25 000 步最陡下降法,继而是 25 000 步共轭梯度法,然后用 500 000 步将两个体系 温度从 0 k 升到 300 k,并在此温度下进行 2 000 000 步动力学平衡。最后,对两个体系分别进 行 200 ns 的分子动力学模拟,运动方程积分步长(时间步长)取 2 fs,每隔 1 ps 记录一次体系坐105标,便于后续的分析。3结果分析3.1 4dx 在蛋白酶表面的附着位置110115图 2 pdb:3kf0 中化合物 dmso 在 hiv-1 蛋白酶表面的结合位与 exo 位对比示意图fig.2 the comparison between dmso binding site and the exo-site on the hiv-1 pr surface in pdb:3kf0图 3 分子动力学过程中化合物 4dx 在 hiv-1 蛋白酶表面附着情况fig.3 the binding statement of fragment 4dx on the hiv-1 pr surface in md120图 4 150ns 时 4dx 在蛋白酶表面结合位置figure.4 the binding site of the fragment 4dx on the pr surface at 150ns图 5 150ns 时 4dx 与 hiv-1 蛋白酶的相互作用fig.5 the interaction between 4dx and hiv-1 pr at 150 ns125130135140145150pdb:3kf0 文件中包含 3 个 dmso 分子和 1 个 4dx 分子,其中一个 dmso 分子和蛋白酶的结合位如图 2 所示,因为它上方紧邻 exo 位, 所以本研究称之为 bexo 位(the bottom of the exo-site),它由 11/1114/14、19/19和 65/6568/68残基构成。dmso 不属于筛选出的候选 化合物,仅在试验中起辅助作用,因此在分子动力学模拟计算中被去除,但其图 2 中的结合位在 本研究中会被涉及。exo 结合位是由一对环区(残基 14/1418/18和 38/3842/42)和一 链 (残基 59/5965/65)形成的如图 2 所示的蛋白酶表面凹槽3。残基 14/14和 65/65构成了 exo 位和 bexo 位的边界。4dx 的羟基与 gly17 形成氢键，它的甲基环己基(the methylcyclohexyl group)与 lys14 和 leu63 形成疏水性结合。exo 位的 38/3842/42和 59/5965/65序列与蛋 白酶的挡板区相连接,flap 的活动与 exo 位为反相关关系,当 flap 打开时,exo 位凹槽会被压 缩;flap 关闭时,exo 位凹槽就会扩大;类似于杠杆3。动力学轨迹通过 vmd 软件视觉呈现后,观察到在 200ns 模拟过程中 4dx 结合位置发生 变化,可分为三个阶段:第一阶段,1-120ns,4dx 结合在 exo 位;第二阶段,120ns-141ns,4dx 脱离 exo 位并在蛋白酶底部表面凹槽组成的凹槽谷中活动;第三阶段,141ns-200ns,4dx 结合在图 2 中的 bexo 位。图 3 为第二阶段简单的图示说明,4dx 在 120125ns 内沿凹槽谷运动脱离 exo 位,131ns 时结合到底部一凹槽并保持到 135ns,在 135140ns 内 4dx 向右运动到 bexo 位凹槽的上方, 之后凹槽与 4dx 相互作用,一方面凹槽形态发生变化以利于 4dx 结合,另一方面 4dx 改变自 身结合方式以纵向方式在 141ns 时嵌入到凹槽内,随后的时间内 4dx 牢固地结合在这一凹槽 内。图 4 为 4dx 在 150ns 时的结合情况。图 5 为 150ns 平衡状态时 4dx 与 hiv-1 蛋白酶的非键结合方式,当把氢键中供体和受体 之间的距离定义在 3.0 之内时,4dx 的羟基与 thr 12 形成氢键。同时发现 4dx 的环己基(the cyclohexyl group)与 ile 13 存在疏水结合。综合分析可得 4dx 与蛋白酶表面结合位的相互作 用主要是其羟基形成的氢键和甲基环己基形成的疏水结合。动力学模拟过程同时说明蛋白酶表面结合位存在一些固有的问题,如结合位凹槽体积小,限制了异位抑制剂的设计和优化,使得异位抑制剂与结合位的非成键结合数目较少;蛋白酶表面结合位没有类似活性位的遮挡结构(flap),这使得异位抑制剂易于脱离蛋白酶表面结合位, 不利于两者的牢固结合;蛋白酶表面结合凹槽的数目和类型比较多,这对异位抑制剂结合位的 筛选提出了挑战。3.2 rmsd 分析155160图 6 两体系蛋白酶骨架碳原子相对初始结构的均方根偏差随时间变化fig.6 rmsd vs. time graph of the pr backbone c atoms relative to their initial structures in md图 7 分子动力学过程中蛋白酶活性位抑制剂和活性位骨架碳原子相对初始结构的均方根偏差随时间变化 fig.7 rmsd vs. time graph of the combination of pr active site inhibitor and active site backbone c atoms relative to their initial structures in md165170175图 6 为动力学过程中两体系蛋白酶骨架碳原子相对初始结构的 rmsd 随时间变化情况。观察到两个体系之间的蛋白酶骨架碳原子的均方根偏差差异明显,异位抑制剂体系的 rmsd 整个模拟过程中比活性位抑制剂体系小。以 4dx 不同的结合位划分为两个阶段分析,即上述 的第一阶段和第三阶段,第一阶段两体系在 30110ns 为平衡状态,异位抑制剂体系的 rmsd 在 1.1 上下浮动,活性位抑制剂体系在 1.2 上下浮动;第三阶段取 145200ns 为平衡状态, 活性位抑制剂体系的 rmsd 值在 130140ns 明显上升,达到了 1.4,异位抑制剂体系一直在1.1 上下浮动。这说明结合 4dx 的异位抑制剂体系比活性位抑制剂体系更稳定。图 7 为两个体系活性位点 asp25/25-thr26/26- gly27/27的骨架碳原子和活性位抑制剂tl-3 原子相对初始结构的 rmsd 随时间变化示意图,可以看出异位抑制剂体系的 rmsd 除3050ns 内与活性位抑制剂体系大小相当外,其它时间比活性位抑制剂体系小。因此 4dx 结 合在 exo 位和 bexo 位都有利于 tl-3 与活性位点的稳定。3.3 蛋白酶残基 b 因子分析图 8 4dx 结合 exo 时两体系残基 b 因子fig.8 b-factor graph of individual residue of two systems when 4dx binds at exo-site180185190195200图 9 4dx 结合 bexo 位时两体系残基 b 因子fig.9 b-factor graph of individual residue of two systems when 4dx binds at the bottom of exo-site4dx 结合在两个结合位时对 hiv-1 蛋白酶残基 b 因子的影响如图 8、9 所示。图 8 为4dx 结合 exo 位时平衡阶段的 b 因子,对 exo 位和挡板区氨基酸残基 b 因子进行分析。挡板 区由 43/4358/58组成的肽段构成,exo 位由 14/1418/18、38/3842/42和 59/5965/65 构成,他们在图 8、9 中表示为 exo-1 位(1418、3842、5965); exo-2 位(113117、137141、158164); flap-1(4258);flap-2(141157)。图 8 中 4dx 结合 exo-1 位,可以看出异位 抑制剂体系中链 1 上 exo-1 位 b 因子比同体系链 2 上 exo-2 小,因此残基柔性小,稳定;且整个 flap 的 b 因子比活性位抑制剂体系小,这些残基同样波动幅度小、柔性弱、稳定。图 9 为 4dx 结合在 bexo 位时平衡阶段的 b 因子,可以看出此时的 4dx 对 flap 的 b 因子影响很小,即对这些残基的波动、柔性性、稳定性无明显作用,同样对其它残基无明显规律性影响。总结分析 可以看出 4dx 结合 exo-1 位时对整个挡板区和 exo-1 位影响比较明显,这些残基活动范围明 显减少,刚性更强,更稳定,使活性位抑制剂不易脱落;4dx 结合 bexo 位时对整个 hiv-1 残基活 动没有表现出明显的稳定作用。3.4 结合自由能分析本研究用 mm-pbsa 方法分别计算了 4dx 两种结合情况下两个体系中活性位抑制剂 tl-3 与 hiv-1 蛋白酶的结合自由能,结果如表 1、2 所示。表中 gele 表示分子力场中静电 能,gvdw 表示分子力场中范德华能,ggas 表示气相能,gpbcal 和 gpbsur 表示 pb 计算方法 中极性溶解能和非极性溶解能,gpbsol 表示 pb 计算方法中极性和非极性的溶解能总 和,gpbtot 表示 pb 模型最终的结合自由能12。其中,气相能为分子力场中静电能、范德华能 和内能三者之和13。由于分子力场中内能在单轨迹近似方法中总是为零6,表中未列出此项。205210215表 1 为 4dx 结合 exo 位时两体系的结合自由能,异位抑制剂体系取 30110ns 平衡时的轨迹进行自由能计算,共提取 200 个快照;活性位抑制剂体系取 30110ns 和 145200ns 的轨 迹进行结合自由能计算,共提取 200 个快照。可以看出异位抑制剂体系中蛋白酶与抑制剂的 结合自由能为-82.41 kcal/mol,活性位抑制剂体系为-68.47 kcal/mol。表 2 为 4dx 结合 bexo 位时两体系的结合自由能对比,此时的异位抑制剂体系取 145200ns 轨迹进行结合自由能计 算,共提取 200 个快照。可以看出异位抑制剂体系中蛋白酶与抑制剂的结合自由能为-84.93 kcal/mol。两种结合情况下异位抑制剂体系的结合自由能数值大小都比活性位抑制剂体系大, 这说明 4dx 结合在 exo 位和 bexo 位时蛋白酶与抑制剂的结合比活性位抑制剂体系牢固。 同时比较异位抑制剂体系中 4dx 结合不同位时的结合自由能可得 4dx 结合在 bexo 位稍好 于 exo 位,但两者差距不大。表 1 4dx 结合 exo 位时 mm-pbsa 计算结合自由能(kcal/mol)tab.1 binding free energy from mm-pbsa when 4dx binds at exo-site(kcal/mol)gelegvdwggasgpbcalgpbsurgpbsolgpbtot异位抑制剂体系-94.58-94.87-189.45117.45-10.41107.04-82.41活性位抑制剂体系-68.67-83.52-152.1993.53-9.8183.92-68.47差值-25.91-11.35-37.2623.92-0.6023.12-13.94表 2 4dx 结合 bexo 位时 mm-pbsa 计算结合自由能(kcal/mol)tab.2 binding free energy from mm-pbsa when 4dx binds at the bottom of exo-site(kcal/mol)gelegvdwggasgpbcalgpbsurgpbsolgpbtot异位抑制剂体系-100.66-94.50-195.16122.80-12.57110.23-84.93活性位抑制剂体系-68.67-83.52-152.1993.53-9.8183.92-68.47差值-31.99-10.98-42.9729.27-2.7626.31-16.462202254结语本研究对 hiv-1 蛋白酶的活性位抑制剂体系和异位抑制剂体系分别进行了 200 纳秒的 分子动力学模拟,发现异位抑制剂体系中的化合物 2-甲基环己醇在长时间动力学模拟后脱离 exo 位,并结合在 exo 位的下方紧邻位,rmsd 分析得活性位抑制剂体系长时间动力学模拟后 变得不稳定。用 mm-pbsa 方法计算了活性位抑制剂 tl-3 与蛋白酶的结合自由能:异位抑制剂体系中当 2-甲基环己醇结合在 exo 位和其下方紧邻位时的结合自由能分别为-82.41 kcal/mol 和-84.93 kcal/mol。分析发现 4dx 结合在 exo 位时扩大了该凹槽体积,同时能够使挡 板区关闭更严实,且抑制并稳定挡板区的活动。4dx 结合在 exo 位下方紧邻位时能够使 tl-3 与蛋白酶结合更牢固,但对挡板区无明显影响。这些分子动力学结果和分析为开发艾滋病新 型抑制剂提供了有价值的线索。230235240245250255260参考文献 (references)1 jasklski m,tomasselli a g,sawyer t k,et al. structure at 2.5-a resolution of chemically synthesized human immunodeficiency virus type 1 protease complexed with a hydroxyethylene-based inhibitorj. biochemistry,1991,30(6): 1600-1609.2 watkins t,resch w,irlbeck d,swanstrom r. selection of high-level resistance to human immunodeficiency virus type 1 protease inhibitorsj. antimicrob agents chemother, 2003,47(2): 759-769.3 perryman al,zhang q,soutter hh,rosenfeld r,mcree de,olson aj,elder je,stout cd. fragment-basedscreen against hiv proteasej. chem biol drug des,2010 march;75(3):257-268.4 时术华,扈国栋,陈建中,等.分子动力学模拟研究质子化态在 hiv-1 protease-indinavir 复合物中的作用j.化学学报,2009,67(24):2791-2797.5 lindorff-larsen k,piana s,palmo k,maragakis p,klep