男性学实验室检查与质控.ppt

王振强 zhen-qiang wang,男性学实验室检查与质控,山西省儿童医院 妇幼保健院 生殖中心 男性学实验室,不育症的发生率为1015，其中约30由于男性因素引起的，统称为男性不育症。 男性不育症患者大部分没有明显的临床症状。 实验室检测是评价男性生殖能力的重要手段。,量 2.0ml或更多 PH 7.2或更多 精子密度 20106ml或更多 总精子数 40106/一次射精或更多 活力 射精后60分钟内，50或更多具有前向运动 （即a+b级），或25或更多具有快速前向运动（a级） 畸形率 85 存活率 50或更多存活 白细胞 1106ml 该指标参考WHO人类精液及精子宫颈粘液相互作用实验室检验手册（第四版）,精液分析正常参考值：,正常精子状态 射出的精液符合参考值 少精子症 精子浓度低于参考值 (精子密度20106ml或总精子数40106/一次射精) 弱精子症 精子活力低于参考值(a+b级50或a级25) 畸精子症 具有正常形态的精子少于参考值(正常形态15%) 少、弱、畸精子症 表示3种变量均异常（两种变量异常时，可用两个前缀） 无精子症 所射精液中无精子 无精液症 不射精,精液变量的术语：,精子宫颈粘液相互作用检测 体内试验（性交后试验）PCT 1. 时间选择 在排卵期进行。 2. 2天避免性生活,性交后912小时进行试验. 3. 在阴道后穹窿部吸取混合样本及用另一个注射器或导管吸取宫颈管内的粘液标本。 将这些标本置于载玻片上，加盖玻片，显微镜观察 结果观察 性交后912小时进行 精子活力分级:a，快速直线前向运动；b，慢或缓慢的前向运动； C，非前向运动；d，不活动精子。 意义: 能够提供精子寿命和存活情况. 前向运动的精子可排除宫颈因素作为不育原因的可能性。,简化的玻片试验 将一滴宫颈粘液置于载玻片上，用盖玻片铺平。 载玻片两侧各滴1滴精液，使其与盖玻片边缘接触，借助于毛细作用使精液移向盖玻片下，在宫颈粘液与精液之间形成一个清晰的接触界面。 该载玻片置于湿润的温箱内，37孵育30分钟 结果报告 正常 精子穿透粘液90%以上具有直线运动的精子 精子穿透粘液相的距离500um（约10个精子的长度） 异常 精子穿透粘液相，但很快失活或仅作“抖动”表示抗精子抗体的存在 精子未穿透精液粘液的接触界面。,男性学组合项目 精液分析操作常规 (参照WHO人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册第四版) 精液标本采集时间应在禁欲后2-7天。嘱病人按取精指南在实验室设立的取精室内采集精液。记录病人及其妻子姓名、联系电话、禁欲时间、标本采集时间及标本分析时间、采集是否完全。 记录精液总量、PH、液化时间、液化状态、外观、粘稠度。 显微镜初检： 用高倍镜（40）观察10个视野，初步估计精子密度、活力、精子凝集和非精子细胞。 估记精子密度40106/ml时，用F-10培养液按比例稀释精液，以避免精子碰撞造成分析错误。取一滴精液置Hamilton CASA系统进行分析。 系统设置：CASA系统温度设置为37，根据精子密度选择Analysis setup: Standard、High density、user-1（低密度精子分析）。 应选择精子分布均匀的视野扫描，如精子密度20106/ml时，应分析超过400条精子。 显微镜检查未见精子的标本应用3000g离心15分钟，把所有沉渣重新悬浮成0.2ml，再彻底检查后发现无精子，才能作出无精子的判断。 如离心后发现有精子可按下列公式计算精子密度。 离心后体积精子密度 精液总量 精子密度（106/ml） 8 精子存活率计数 将新鲜精液与伊红染液1：1在试管中混匀，30秒后取一滴上述液体置载玻片上并覆以盖玻片在400倍光学显微镜下观察。活精子不着色，死精子被染成红色，观察200个精子计数存活率。,男性学组合项目 计算机辅助精子分析（CASA） VCL-曲线速度（m/s）精子头沿其实际的曲线。 VSL-直线速度（m/s）根据精子头在开始检测时的位置与最后所处位置之间的直线运动的时间平均速度。 VAP-平均路径速度（m/s）精子头沿其空间平均轨迹移动的时间平均速度。 ALH精子头侧摆幅度（m/s）精子头沿其空间平均轨迹侧摆的幅度。 LIH-直线性。曲线轨迹的直线性。VSL/VCL. WOB-摆动性。精子头沿其实际轨迹的空间平均路径摆动的尺度。VAP/VCL. STR-前向性。空间平均路径的直线性。VSL/VAP. BCF-鞭打频率（鞭打次数、秒）。精子曲线轨迹越过其平均路径轨迹的时间平均速度。 MAD-平均移动角度（度）精子头沿其曲线轨迹瞬间转折角度的时间平均绝对值。,男性学组合项目 9 精子形态评估： 涂片 取一小滴精液（5 20 ul）于载玻片上，以另一推片把精液推成薄片，干燥。如果精子密度超过20106 / ml, 取5l，精子密度 20l ,应取1020l精液。 染色方法 采用改良巴氏染色。实验方法见附2。 精子形态分类 在100油镜下及10目镜分析200条带尾部的可辨认精子的形态。计数百分率。报告四种类型缺陷：头部畸型、颈部和中段畸型、尾部畸型、混合畸型。按照第四版精子形态分类标准，将所有形态学处于临界状态的精子均列为异常。 在形态分类的同时如果见到许多尖头，需要单独记录。 精子形态分析时，同时计数非精子细胞成份，包括未成熟精细胞和白细胞等。按下列公式计数精液中的非精子细胞密度。 C = NS 100 N= 计数100个精子相同视野中一种特定细胞类型的数目。 S= 精子细胞密度（106 / ml）。 C= 特定细胞类型密度（106 / ml）。,多重精子缺陷指数分析 临床意义： 形态异常的精子经常有多种缺陷。在较早的方案中，当多种缺陷同时存在时，只记录其中一种，即头部的缺陷先于中段的缺陷，中段的缺陷先于尾部的缺陷。现在用一种叫做畸形精子指数的方法（teratozoospermia index,TZI）或多种异常指数（multiple anomalies index,MAI），即用缺陷总数除以畸形精子数目，以及用精子畸形指数（sperm deformity index,SDI），即缺陷总数除以精子总数。这些参数预示精子在体内和体外的功能情况。畸形精子指数的数值介于1.00（每个异常精子只有一种缺陷）和3.00（每个异常精子都有头、中段及尾部缺陷）之间。报道提示，畸形精子指数（TZI）1.6与未治疗不育夫妇的低生育率有关，精子畸形指数SDI 1.6提示体外受精失败的阈值。,精子顶体酶测定 顶体酶存在于精子顶体内膜及赤道部膜上， 是受精过程中重要的蛋白水解酶. 当精子头部进入卵透明带，顶体酶原被活化为顶体酶水解卵透明带，使精子穿过卵透明带最终与卵子融合。 顶体酶活性反映精子质量，顶体酶活力不足可能导致不育。临床精子成活率低、死精子症以及严重生殖系统感染，特别是溶脲支原体严重感染时可造成精子顶体酶活性降低。 顶体酶活性是判断男性精子功能和生育力强弱的重要评价指标。,男性学组合项目,男性学组合项目,免疫性不育检测指标:精子膜表面抗体 混合凝集反应（MAR） 检测的是不需要任何处理的精子 和免疫珠试验（IBT）检测的是经洗涤后的精子 阳性 10%活动精子包裹在致敏微球上 MAR是WHO推荐的免疫性不育诊断方法 作为精子膜表面抗体常规筛选方法,前列腺分泌功能指标 精浆锌：与精子活力、抗氧化及前列腺分泌功能有关 精浆柠檬酸：与前列腺分泌功能，精液液化有关 精浆酸性磷酸酶:与前列腺炎有关 精子顶体酶活性定量检测 判断男性精子功能和生育力强弱的重要评价指标，顶体酶活性降低精子将难以穿透卵细胞从而导致不育。 核蛋白组型转换 蛋白组型转换缺陷或异常可引起男性不育或胚胎早期夭折流产。,男性学组合项目二,精子体外处理方法： 洗涤法 上游法 密度梯度离心法,洗涤法 目的：增加活动精子密度和洗去精浆中影响精子活力的物质，如白细胞、细菌、抗精子抗体等。 方法： 选用Hams F10、HTF、Earles等上述任何一种培养液，加10血清及抗生素。 液化精液移于15ml锥形离心管内，加3倍剂量的培养液。 离心500g8，弃上清夜，同法重复洗涤一次。 留沉淀加入0.5ml培养液，制成精子悬液，密度调整为40106/ml,上游法 目的： 利用活动精子具有主动游过液体界面进入不同培养液的能力，而达到自行与死精，凝集精子，畸形精子和细胞杂质分离。 适用于正常精液液化不良精液。 方法： 液化精液1：3加入培养液，离心200g8，洗涤2次。 留沉淀加入0.5ml培养液，制成精子悬液。 取另一支试管加入1ml培养液，将0.5ml精子悬液慢慢加入试管底部，形成上下二个两面。 5CO2、37孵箱内静置1h。 收集上游精子，备用,密度梯度离心法 目的：利用不同成熟阶段的精子和各种细胞成分各自的密度，差异使之在不同浓度的溶液中，在离心力作用下停留在不同密度面的界面上，达到较好的分离。适用于精液粘稠、严重少精 弱精症。 *标准二层Puresperm法(80%、40%) 方法 在锥形离心管底依次加入1.52ml 80、40 Puresperm液。 将2ml精液加到40 Puresperm液界面上，离心300g20” 弃上层液体、留沉淀物、加5ml Puresperm wash、离心500g10同法洗涤2次 留沉淀物，加0.5ml SpermAssist制成精子悬液备用。,精液分析在男性生殖力的评估中 起着极为重要的作用,但是不同实验室 测同一份样本的结果常有较大差异 这说明男性学实验室各项指标 的质控是结果可信度的保证,男性学实验室质量控制规则 随时样本结果的监测和对比； 每周分析不同技术员所做的主要精液 指标的重复测量值； 每月分析检测结果的月均值； 每季校正加样器； 每年校正计数板和其他设备。,质控图的基本控制原则 控制原则 误差敏感 一个结果超出处置限 随机误差或系统误差 连续两个结果都超出警戒上限 系统误差 或低于警戒下限 连续两个结果,一个高于警戒上限, 随机误差 一个低于警戒下限 连续八个结果全部高于或低于均值 系统性误差,精子体外存活试验 液化精液1：3加入培养液50010 离心去上清液，重复洗涤一次。 留沉淀物制成1ml精子悬液，再加入2ml培养液使其形成上下二层界面，37、5CO2孵箱中静置1小时。 吸取上清夜，调节上游精子密度105106/ml，活率95。 37、5CO2孵箱内培养3天，活率70%。,培养液、一次性耗材质