高效液相色谱法123.ppt

第12章 高效液相色谱法,high performance liquid chromatography,hplc,hplc与经典lc区别,第2节 基本理论-速率理论,一、柱内展宽,csm为静态流动相传质阻力系数,组分在色谱柱中运行时间不同，导致色谱峰展宽。 影响因素：固定相的粒度和填充均匀程度,涡 流 扩散 项 a,减少方法 ： a 降低dp：目前商品柱多采用3-5m粒径 b 降低：采用球形、均匀分布固定相。,b=2dm dm t/,2. 纵 向 扩 散 项 b/u,样品分子沿流动相方向产生扩散，所引起峰展宽,3.流动的流动相传质阻力项cmu,流动相本身，处于不同层流的分子具有不同流速。,dm t/,减免方法：1）减少固定相颗粒直径 2）减少流动相液体黏度（甲醇）,4. 静态流动相传质阻力项csmu,原因：处于固定相颗粒内部孔洞内静态流动相引起,影响csmu的因素与cm相同,5. 固定相的传质阻力项csu,影响因素：固定相内部阻力影响,减免方法：减少固定相液膜厚度 化学键合相,6、hplc法中分离条件的选择,h = a + （cm+csm）u,1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp10m） 首选化学键合相，匀浆法装柱,2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相甲醇，1ml/min 3. 柱温的选择： 选室温25-300c左右。太低，流动相黏度增加，太高容易产生气泡,二、柱 外 展 宽,减免方法：应尽可能减少柱外死体积,从进样器到检测器之间的体积称柱外死体积，均可导致色谱展宽，柱效下降。,第3节 各类高效液相色谱法,吸附色谱法 化学键合相 离子对色谱法,一、吸 附 色 谱 法,1分离原理,2固定相：极性和非极性固定相,3流动相：底剂（烷烃）+ 有机极性调节剂,二、 化学键合相色谱法,（bonded phase chromatography, bpc）,化学键合相：采用化学反应的方法 将固定液的官能团键合在载体表面上。,优点：固定相不易流失 适用于各种样品的分离分析,正相键合相色谱法： 极性键合相，如氨基柱、氰基柱 适用：极性化合物,反相键合相色谱法： 非极性键合相，如c18柱、c8柱 适用：非极性至中等极性化合物,分 类,1）分离原理 流动相与溶质有排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合，且缔合反应是可逆的。 k，组分tr,1、反相键合相色谱法（rp-hplc）,2）固定相：极性小的烷基键合相 c8柱，c18柱（ods柱） 十八烷基键合相：常用的非极性键合相,反相键合相色谱法（rp-hplc）,低碳型： r1、r2都是氯,高碳型：r1、r2是两个甲基 特点：载样量大，保留能力强,键 合 相 分 类,中碳型：r1、r2其中一个是氢，一个为氯,表面覆盖度：参加反应的硅醇基数目，占硅胶表面硅醇基总数的比例。,作用：决定了键合相是分配还是吸附占主导,封尾：为了减少残余的硅醇基，一般在键合反应后，用三甲基氯硅烷等小分子进行钝化处理。,3）流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水 流动相极性 固定相极性 底剂 + 有机调节剂（极性调节剂） 例：水 + 甲醇，乙腈，四氢呋喃,反相键合相色谱法（rp-hplc）,4）流动相极性与k的关系： 流动相极性，洗脱能力，k，组分tr 5）出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱 6）适用：非极性-中等极性组分,反相键合相色谱法（rp-hplc）,用ods柱分离苯、甲苯，流动相为甲醇-水（95：5） 问：哪个先出柱 若要增大tr，应增大甲醇还是水的比例?,例：,1）分离机制： 2）固定相：极性大的氰基或氨基键合相 3）流动相：极性小 底剂 + 有机极性调节剂 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇,2、正相键合相色谱法（np-hplc）,4）流动相极性与k的关系： 流动相极性，洗脱能力，组分tr，k 5）出柱顺序：极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱,正相键合相色谱法（np-hplc）,6）适用： 氰基键合相：与硅胶的柱选择性相似 氨基键合相：糖类等,3离子对色谱法（ipc或pic）,反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分 与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tr，以改善分离,1）离子对试剂：烷基磺酸钠分析碱 四丁基季胺盐分析酸 2）影响k的因素 a与m的极性有关（同反相色谱） b与r的链长有关：r长，极性小，tr，k 3）适用：较强的有机酸、碱,3洗脱方式,1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 类似gc的等温度洗脱 2）梯度洗脱： 在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例 即不断改变其极性（两个泵） 适于分析极性差别较大的复杂组分 类似gc的程序升温（沸程较长样品）,phenomenex luna c18（250mm4.6mm，5m）色谱柱 (aschaffenburg, germany)。流动相：(a)乙腈-(b)0.3%醋酸水溶液进行梯度洗脱： 0-30min：a 28%，b 72%； 30-53min： a 28升至34，b 72降至66； 53-70min： a 34升至80，b 66降至20。 流速：1.0 mlmin-1； 检测波长：275 nm； 进样量：20l； 柱温：30；,流动相的性质和选择,1、流动相的物理性质,1)流动相要求： 易得易纯化，无毒不易燃。 检测器的适应性:如紫外检测器对 溶剂的透明波长要求；示差折光不能 用梯度洗脱 对样品有一定溶解度而不反应 纯净,低廉,低粘度(510-4pa.s), 低沸点(柱温(2050),2)流动相的物理性质,沸点bp、分子量m、密度、介电常数e 粘度、折射率ri、紫外吸收截止波长 溶剂强度参数(al2o3)、溶解度参数 (色散d、取向极性0、受质子a 给质子h)、溶剂极性参数p/ (质子接 受xe、给质子xd、偶极xn)、选择性分 组、表面张力、离子对色谱溶剂强度 (p/+0.25e),常用于hplc流动相溶剂的性质,溶剂的强度因素,p/ 规定：戊烷在al2o3的=0,(硅胶)=(al2o3)0.77,混合溶剂 ?,n摩尔分数;nb为吸附剂吸一个b分子所占面积,吸附剂 活性。一般0.61.0, nb=4-6随b分子体积而变化,0：液-固色谱中溶剂强度参数，反 映溶剂分子对吸附剂亲和力。 经验：0减小0.05，k值增加13倍,溶解度参数,ec是1mol气体变液体释放能量; vm液体摩尔体积,=色散+偶极+接受质子+给出质子,极性参数p/,kg为极性分配系数,p:液-液色谱溶剂极性参数，表示溶 剂洗脱强度和溶剂的选择性,经验：p改变2单位，k值改变10倍,极性参数p与溶剂强度参数关系投影,粘度参数,注意:溶剂常用0.4-0.5mpa.s,太大柱 效下降,大小易成气泡,混合时一般粘 度变化非线性,1 2 3 4,水0,b100,1.正丙醇 2.乙醇 3.甲醇 4.乙腈,2、溶剂的选择性与分类(snyder),k与分子之间作用力？,色散力、偶极力、氢键力,参考物的选择,(snyder法),强偶极作用-硝基甲烷-xn 质子给予体-乙醇-xd 质子接受体-二氧六环-xe,参考物与被检溶剂间作用力关系表,表2 snyder的溶剂选择性分组,混合溶剂p/：?,注:模糊聚类法,把溶剂对质子给予体、质子接受体、电 子给予体、电子接受体和定向作用力化 合物的选择性五个参数进行分类，选择 21种常用溶剂,表 混合溶剂的溶剂特性,举例：在反相色谱中，计算甲醇-水 (60:40)的溶剂溶剂强度，如果改用 相同强度的乙腈-水溶剂，四氢呋喃 和水其比例是多少？,解：查表得甲醇、乙腈、四氢呋喃和 水的溶剂强度s分别为2.6,3.2,4.5,0,甲醇-水：s=0.602.6+0.400=1.56,乙腈-水 s=x3.2+(1-x)0=1.56 x=0.49,thf-水 s=x4.5+(1-y)0=1.56 y=0.35,2)选择一般原则,正相键合相 反相键合相 主体溶剂 正已烷(正庚烷、正戊烷) 水 选择性溶剂 a.质子接受体 乙醚或甲基叔丁基醚 甲醇* b.质子给予体 氯仿 乙腈* c.偶极 二氯甲烷 四氢呋喃*,3溶剂优化的步骤：,1.首选择溶剂 2.多元溶剂系统组成 3.洗脱能力的选择(,p/,s)调k 重点组分k=(t-t0)/t0 3 4.改变溶剂系统改变选择性 5.混合溶剂优化 6.ph缓冲剂、胺、配合物、添加剂离子强度调节剂 7.组分性质差别大可用梯度洗脱,如:四面体-三角形法 1选择乙腈-水, 2.比例100%往下调节确定k值而得最适合的比例.图9-29,3.改变溶剂:甲醇-水;thf-水比例计算 找等洗脱强度三角形,图9-30,4.混合溶剂:三元、四元,图9-33,5.七种溶剂流动相色谱分析,图9-34,4、色谱分离条件的优化指标,1)色谱响应系数,其中:p=f/g,n相邻峰对数;tm最大 容许时间,tl实际时间，常数,2)色谱优化函数,ai权重因子,r分离度 cof绝对值越大越差,举例取代萘混合物分离的优化试验,色谱柱：zorbax-c8（1500.46cm）,1.选择溶剂强度使溶质容量因子在