基因组学02-51-05-35-159.ppt

18 基因组学与后基因组学,18.1 人类基因组计划与基因组学 1 基因组：生物体配子中所包含的全部染色体及其基因，还包括细胞质基因组。 基因组学:研究生物体内基因组的分子特征。 以整个基因组为研究对象，而不是以单个基因为 单位作为研究对象。,主要目标： 认识基因组的结构、功能和进化； 阐明整个基因组所包含的遗传信息和相互关系； 充分利用有效资源， 预防和治疗人类疾病。,2 人类基因组计划 1990年，国际人类基因组计划启动； 基因组计划具体分为： 构建基因组的遗传图谱； 构建基因组的物理图谱； 测定基因组DNA的全部序列； 绘制基因组的转录本图谱； 分析基因组的功能。,3、人类基因组的特点,大小：3.2109bp; 基因和基因相关序列：1200 Mb，其中基因编码的序列为48 Mb，基因相关序列为1152 Mb，包括假基因、基因片段和内含子以及非翻译区； 基因间相关序列：2000 Mb，其中散在重复序列（IRS）为1400 Mb,包括64 Mb长散在核元件、420 Mb短散在核元件、250 Mb长末端重复序列和90 Mb的DNA转座子；基因间DNA序列还包括600 Mb的其他的基因间区域序列，包括90 Mb的微卫星序列和510 Mb的各种间隔区。,4、水稻基因组计划,18.2 基因组图谱的构建,利用现有DNA测序方法，每个测序反应通常只能得到800个核苷酸的序列。 所以，小基因组物种常用鸟枪射击法。,大基因组测序存在两个问题： 片段数(n)庞大，片段间连接和装配非常复杂，重叠数为2n22n。 基因组中相同或相似的重复序列在连接和装配时容易出错。,大基因组测序方法： 克隆连续序列法 定向鸟枪射击法,克隆连续序列法：DNA切割成长度为0.1-1Mb的大片段克隆到YAC或BAC载体上分别测定单个克隆序列再装配连接成连续的DNA分子。,定向鸟枪射击法：以基因组图谱中标记为依据测序装配和构建不同DNA片段的序列。,基因组图谱根据构建的途径，可分为两种： 遗传图谱：根据遗传性状（如已知基因位点、功能未知的DNA标记、可鉴别的表型性状）的分离比例将其定位在基因组中，构建相应的连锁图谱。 物理图谱：将各种标记直接定位在基因库中的某一位点上。,1 遗传图谱： 1）图谱标记：可用基因和DNA作为鉴别的标记。,基因标记：基因控制性状的表现，利用可鉴别的形态、生化等表型性状作标记根据连锁交换原理来分析基因之间的连锁关系和遗传距离绘制连锁图谱。,缺点：基因数目有限，所构建的遗传图谱不详细，标记间的遗传距离较大。, DNA标记 RFLP（限制性内切酶多态性）：限制性内切酶能识别和切割特异核苷酸序列。由于DNA某一位点上的变异有可能引起该位点特异性的酶切位点的改变，当用限制性内切酶处理不同生物个体的DNA时，致使酶切片段长度发生变化，个体间出现限制性片段长度的差异。DNA序列能或不能被某一酶酶切，实际上相当于一对等位基因的差异。,如一对同源染色体的两个DNA分子,一个具有某种酶切位点,另一个无此位点,酶切后形成的DNA片段长度就有差异,即RFLP.根据该等位基因的遗传,将RFLP作为标记定位在基因组的某一位置上。 RFLP表现为共显性遗传。,SSLP（简单序列长度多态性）：SSLP是一些长度不等的重复序列，有多个等位基因位点。 小卫星：重复序列为16-100个核苷酸，主要分布在染色体末端。 微卫星（SSR）：重复序列只有2-6个核苷酸，分布在整个基因组。 小卫星和微卫星称为可变数目串联重复（VNTRS），呈共显性遗传。,SNP（单核苷酸多态性）：同一物种不同个体基因组DNA的等位序列上单个核苷酸存在差异的现象。比较的的是DNA相同序列长度里的单个碱基的差别。基因中的点突变数量多，其中有些可产生RFLP。,SNP存在频率较高，既可存在于编码序列中，也可存在与非编码序列中。人类基因组中约有300万个以上，平均每500-1000bp就有一个。其中编码序列中约有20万个SNP标记，非编码序列中约有10倍以上的标记。,SNP标记可用DNA芯片技术检测：将不同的寡核苷酸固定在芯片上，标记待测DNA，一次旧棵检测很多SNP标记。,2）遗传图谱的构建 人类基因组遗传图谱的构建 家系分析法：分析8个家系134个成员（186个减数分裂）根据5264个SSR标记绘制而成。对于X染色体，另外利用12个家系的170个成员分析（105个减数分裂）将5264个标记定位在2335个位点上构建的人类基因组遗传图谱密度为每个标记599kb., 植物基因组遗传图谱的构建,1） 选择亲本：要求亲缘关系远，遗传差异大，亲本间分子标记具有多态性。,2）产生构图群体：配制杂交组合，建立分离群体。,P1P2 P3F1 回交群体 三交群体 F2 单倍体 RIL DH,组织培养,连续回交,连续自交,染色体加倍,重组近交系 双单倍体,3）遗传标记的染色体定位,有单体、三体、代换系、附加系分析等方法。依据染色体剂量的差异将遗传标记定位在特定染色体上。当供体材料总DNA等量时，DNA杂交带的信号强弱与该标记所处的染色体剂量成正比。,4）标记间的连锁分析：通过分析分离群体内双亲间有多态性遗传标记间的连锁交换情况,确定标记间的连锁关系和遗传距离。,2、物理图谱的构建,（1）构建物理图谱的原因 1）遗传图谱有限的分辨率 对于人类或其他高等生物不可能得到大量的子代群体，减数分裂的后代有限，限制了连锁分析。 2）遗传图谱的精确性不高 染色体上存在重组热点，影响邻近区段的遗传图谱的准确性。,（2）构建物理图谱的三条途径,1）限制性酶切图谱,识别位点较多的内切酶：如Not，其8个核苷酸出现的频率为1/48=1/65536bp，而识别位点为6个核苷酸的出现频率为1/46=1/4094bp. 其酶切位点在基因组中出现频率低的内切酶： Sma 酶切DNA，每78kb只有1个切点。 BssH 酶切DNA，每390kb只有1个切点。 Not 酶切DNA，每10Mb 只有一个切点。,2）荧光原位杂交（Fluorescent in situ hybridization),FISH)：通过荧光标记的探针与DNA分子杂交，杂交信号即探针DNA在染色体上的图谱位点。 步骤：取处于有丝分裂中期的细胞制片，将染色体变性成单链，在将标记的DNA探针变性后杂交到染色体上，保温处理后，显微镜下直接观察。,3）序列标签位点 利用某一已知序列为标签的位点（sequence tagged sites,STS)作探针，与DNA杂交，绘制物理图谱。 STS的要求： 已知序列，便于PCR检测； 基因组中仅一个位点，无重复。,常用的两大类型： 特异DNA序列 表达的序列标签（expressed sequence tag,EST),该序列来自cDNA.DNA随机片段测序后经比较分析，其非重复序列可作为STS。 DNA片段 辐射杂交系：啮齿类动物细胞中含有另一个生物染色体片段的细胞株。,用3000rad X 射线处理后，人类染色体出现随机断裂，将处理细胞与正常的仓鼠或其他啮齿类动物细胞融合，断裂的人类染色体可与仓鼠染色体融合。人类基因组辐射后与缺失仓鼠细胞融合后形成辐照细胞系，能在HAT培养基上生长的就是含有人类染色体片段的细胞，可用于人类基因组物理图谱的构建。,（3）人类基因组物理图谱 人类基因组序列开始测定时，已有45万个EST，其中有一些重复序列，经计算机分析筛选后得到49625个，各代表一个基因。再从中筛选出3万个EST、2个辐射杂交系库（分别有83和93个细胞株）、1个有32000个克隆的YAC文库，用于构建物理图谱。 构建物理图谱的密度为每个标记183Kb。EST分布结果表明，基因在染色体上的排列是不均匀的。 将物理图谱和遗传图谱整合而成更加完整的人类基因组图谱，作为基因组测序的眶架和分析的依据。,3、基因组图谱的应用 基因图谱的构建除用于进行测序外，还有其他用途： 1、基因定位； 2、基因的克隆与分离； 3、基因组比较分析； 4、基因功能的预测； 5、标记辅助选择 饱和基因组图谱可用来确定与任何一个目的基因紧密连锁的分子标记，根据图谱间接选择目的基因，可降低连锁累赘，加速目的基因的转移和利用，提高回交育种的效率。,18.4 基因组DNA的大片段文库的构建,18.4.1 酵母人工染色体（YAC）文库 YAC 含有以下必须元件： 端粒DNA序列（telomeric repeat ， TEL）：定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的 DNA 不被细胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。, 着丝粒（centromere ， CEN）：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点， 使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中 。在 YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。 自主复制序列（autonomously replication sequences，ARS） 一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号。,将三种必须元件从染色体上分离出来，按照顺序利用重组技术重组而成人造微小染色体，将这种线状小染色体转化进入酵母细胞后，可正常的复制、配对、分离。再组装上多克隆位点和选择标记等即为酵母人工染色体载体。,YAC 载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因trp 1、leu2和his3、尿嘧啶合成缺陷型基因ura3 等，以及赭石突变抑制基因sup4。,YAC 载体的工作原理(P442图18-10): BamH切割后形成微型酵母染色体EcoR切割sup4 内部的位点形成染色体的两臂与外源DNA 在该切点相连形成人工酵母染色体转化入酵母菌通过复制、分裂，克隆大片段DNA 。 YAC 文库装载的 DNA 片段的大小一般可达 200-500kb，有的可达 1Mb 以上，甚至达到 2Mb 。,YAC的主要缺点： 1存在高比例的嵌合体，即一个YAC克隆含有两个本来不相连的独立片段； 2部分克隆子不稳定，在转代培养中可能会发生缺失或重排； 3插入DNA片段的分离和纯化困难，因为YAC与酵母染色体具有相似的结构。 4转化效率低。,18.4.2 细菌人工染色体,细菌人工染色体（BAC）：以细菌F因子为基础，人工构建的环状的DNA分子。可以携带大于100-350Kb的外源DNA片段。,BAC载体的优点： 较为稳定；没有嵌合现象；转化效率高； BAC克隆易于操作和DNA提取；BAC文库筛选方便。,选择标记：氯霉素抗性基因等。,18.5 后基因组学 2003年4月14日，人类基因组序列图绘制成功，但对于90%以上的人类基因尚不了解其功能。 后基因组学研究基因组的基因功能，基因之间的相互关系和调控机制的学科。 目前已衍生出了许多新兴学科： 1）比较基因组学； 2）功能基因组学； 3）蛋白质组学； 4）疾病基因组学 5）药物基因组学； 6）生物信息学,18.5.1 比较基因组学,对同一物种不同个体以及不同物种的基因组进行比较,分析基因的大小、数量,基因排列顺序,编码序列与非编码序列的特征以及物种进化关系等的学科。不仅可以揭示生命的起源、进化等重大生物学问题，还具有潜在的实用价值。如通过细菌和人类的基因组比较研究，有可能筛选出只在细菌中存在的基因，成为新的抗菌素的药靶。,18.5.2 功能基因组学,DNA芯片技术： 面积不大的基片（氧化硅、玻璃或尼龙等材料制成）表面分成不同小格有序的点阵排列核苷酸分子（不同基因、cDNA的DNA片段或寡核苷酸）将待分析的核苷酸分子标记变性成单链，与芯片上的核苷酸分子杂交洗掉芯片上序列不同的核苷酸分子利用高精度的激光扫描仪记录已杂交分子的荧光信号计算机分析。,应用领域：基因多态性检测； 基因表达分析； 克隆选择及文库筛选（如cDNA文库） 基因突变检测及遗传病和肿瘤的诊断等。,18.5.3 蛋白质组学 蛋白质组：一个基因组所表达的全部蛋白质。 蛋白质组学：在蛋白质水平研究基因组的基因表达，分析基因组的蛋白质类型、空间结构变异以及相互作用的机制。,双相电泳技术：第一相是以蛋白质的电荷差异为基础进行分离的等电聚焦，第二相是以蛋白质分子量差异为基础的SDS-PAGE。,18.6 基因组的进化,18.6.1 基因组进化的分子基础,变异是进化的基础。 生物体变异主要因素： 基因突变； 基因重组与基因互作； 染色体结构变异； 染色体数量变异。,18.6.2 基因组的起源,（1）RNA起源假说 RNA分子既能催化生化反应，又能自我复制。 如RNA结合氨基酸生成tRNA；RNA促进邻近两个tRNA结合在RNA模板上催化肽链的生成，并合成蛋白质；RNA分子突变形成了DNA，或以RNA为模板合成DNA。,（2）原基因组的形成,由原始的RNA分子复制形成重复序列，在进化过程中产生断裂基因。原基因组即由重复序列和原始的断裂基因组成。,基因组测序分析表明：不同物种间存在同源基因，同源基因的百分比物种间的亲缘关系紧密相关。,18.6.3 基因组的进化,（1）基因组大小的进化 包括基因组的含量