流行性脑脊髓膜炎实验室诊断.ppt

流行性脑脊髓膜炎实验室诊断,天津市卫生防病中心病原生物学部 井良义,何谓流行性脑脊髓膜炎？,流行性脑脊髓膜炎（简称流脑），是由脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitides，Nm）通过呼吸道传播所引起的化脓性脑膜炎，常在冬春季节引起发病与流行,患者以儿童为多见，现在成年人发病有增多趋势。人受Nm 感染后大多数表现为鼻咽部带菌状态，只有少数成为流脑患者。,正常人群中Nm带菌率可达5 30%。，带菌者为流脑流行的重要传染源。 细菌经飞沫传播，患者潜伏期1 4天，其发展经过可分为三期： 1.首先侵入鼻咽腔，引起上呼吸道感染，有时局部有炎症。 2.少数细菌侵入血流，造成单纯 菌血症，可有突然发作的恶寒、发热、恶心、呕吐等，并可有出血性或红斑性皮疹，或称淤血点。 3.大量细菌侵入，由血液或淋巴到达脑脊髓膜，引起脑脊髓膜炎的症状与体征，如头痛、呕吐、颈项强直、发热等一般脑膜炎症状。,适宜的检测样品,鼻咽拭子、血液、皮肤粘膜出血点挤出液、血清及脑脊液等。 其中脑脊液、血液、皮肤粘膜出血点挤出液中检出脑膜炎奈瑟氏菌可直接作为确诊依据。,样品采集与运送,样品采集（一）,脑脊液：无菌操作，吸出CSF 35mL，立即放到无菌试管内离心(2000 3000r/min，30min)，用灭菌过的毛细管吸取沉淀物直接接种到10羊血巧克力色琼脂上(CSF上清液部分供检测Nm特异抗原，亦可将其置于20待测)，5二氧化碳环境37培养24 72h，每日检查细菌生长的情况，及时分离纯培养物供鉴定。,样品采集（二）,血液：采取病人急性期静脉血液6mL，无菌操作往盛有30mL增菌用的葡萄糖肉汤三角瓶内注入4mL血液(余下的2mL血液同上离心后吸出血清，供检测Nm特异抗原和抗体，亦可将其置于一20待测)，同上述条件培养2472h，每日进行分离培养。,样品采集（三）,淤血点：选病人皮肤上的新鲜淤血点或淤斑，消毒后用针头挑破，挤出组织液，用无菌棉签蘸取先接种含双抗的葡萄糖增菌肉汤管中增菌812h后分离培养或直接接种10羊血巧克力色琼脂；涂片，干后革兰染色，直接镜检。,样品采集（四）,咽拭子：用长柄棉拭子采咽后壁两侧分泌物，立即接种卵黄双抗培养基或巧克力双抗平板，也可将咽拭子放入液体双抗增菌管内，增菌8 12h后分离培养 。,咽拭子接种,咽拭子接种,不合格咽拭子接种,不合格咽拭子接种,样品的处理和运送,早期采集样品：应尽可能采集病人用药前的早期样品，这可以明显提高病原的检出水平。 及时处理样品：应尽可能地做到床边接种，若无可能则应在最短的时间内送到实验室进行接种培养。 保温运送：应尽可能保持样品处于2036之间，切记不能低温运送（检测抗体的血清标本除外）。,流脑病原学检查方法,生长特性,脑膜炎双球菌为专性需氧菌，初次分离时需510%的二氧化碳环境才能生长，最适生长温度为37 。,菌落特征及菌体形态,菌落：Nm接种于巧克力色琼脂平皿上，5%CO2，37 培养24小时后，其菌落直径约1mm ，表面突起、光滑、湿润、圆整、略带灰白色、半透明、不溶血、无色素。 细菌形态：为革兰氏阴性，呈卵圆形和肾形，0.80.6大小。常成对排列，邻近两边扁平凹陷,菌 落 特 征,菌 落 特 征,脑 脊 液 涂 片,生化特征,分解葡萄糖和麦芽糖，产酸不产气。 不分离蔗糖、果糖和乳糖。 过氧化酶和氧化酶阳性,血清分群鉴定,检查从病人分离的疑似Nm时，先用多价、多价、多价抗血清检测，如果阳性再用分群血清（A群、 B群、C群、W135群抗血清等）检测。 不与盐水发生凝集，与一种脑膜炎抗血清发生凝集反应，即为某一型的流脑菌。 在盐水中发生凝集反应，不能作为抗血清分群。,菌种保存,短期保存：保存脑膜炎双球菌，用卵黄盐水保存，可保存7天。 2长期保存：最好方法是低温冷冻或冷冻干燥。所有的细菌都可在-70冰箱中冷冻保存。将脑膜炎双球菌接种巧克力平板中，放二氧化碳培养箱中35 37 孵育18 20小时，收集细菌放到含1ml脱脂牛奶的2ml螺盖冷冻瓶中。将菌苔在管壁研磨振荡，使细菌分散在培养基中。-70 低温冰箱分类保存。,流脑血清学检查方法（一）,玻片凝集试验:应用玻片凝集试验对Nm病原菌株或带菌者菌株进行血清学分群。 Nm诊断血清：国产售品有多价（包含A、B、C、D群），多价 含1889（Y）、 1890（H）、1892（29E），多价含319（W135）、1916（X）、1486（I）、1811（K）群及各群单价血清，共计14种。（括号内为国际编码）,流脑血清学检查方法（二）,酶联免疫吸附试验（ELISA）：应用ELISA间接法测病人急性期和恢复期血清中抗A群流脑IgG的抗体水平。此方法也可以应用于健康者血清抗体的测定。若病人恢复期血清抗体效价较急性期呈现4或4倍以上升高有追溯诊断的意义。,流脑血清学检查方法（三）,杀菌力试验：应用微量杀菌力试验(TTC法)测定病人急性期和恢复期血清中对Nm的杀菌抗体水平。此方法也可用于健康人群的血清抗体测定。,流脑其它检查方法（一）,胶乳凝集试验应用胶乳凝集实验测定病人CSF、急性期血清和尿中Nm群特异抗原，辅助流脑临床诊断。可用市售的脑膜炎乳胶凝集试剂盒（如法国梅里埃公司的试剂盒）。方法：一滴乳胶试剂（30l）加上一滴病人的脑脊液，涂匀，在2分钟内出现明显凝集者为阳性。,流脑其它检查方法（二）,PCR检测：应用PCR检查病人急性期血清或CSF中Nm的DNA特异片段，对流脑病人进行早期诊断。,培养基制备,巧克力色血液琼脂： 成份：营养琼脂（pH7.6） 100ml 脱纤维血 510ml 制法：将营养琼脂溶解，以无菌手续加入羊血，摇匀。置水浴锅内，维持在902030min。待培养基冷至50 时才倾注平板。如做病人密切接触者或健康人群带菌调查时，则需加双抗，每1000ml培养基加入多粘菌素4.2mg（或2.5万单位），万古霉素3.3mg。,卵黄盐水,将新鲜鸡蛋洗净，在70%酒精中浸泡消毒1h后取出，用3%碘酒消毒蛋壳，以无菌操作于鸡蛋的一端开一小孔，使蛋清全部流尽，蛋黄倒入置有玻璃珠的三个烧瓶中，打碎后，一份蛋黄加一份生理盐水，再在摇珠瓶中振摇，使其混匀呈乳状分装试管，56 加温30 min ，置37 作无菌试验。（脑膜炎双球菌保菌用）,增菌肉汤,成份：新鲜牛肉汤 100ml 葡萄糖 0.5g 配制： 混合上述成份，调pH至7.47.6分装试管，2ml/管或30ml/瓶，高压灭菌10磅10分钟，无菌检验合格后供增菌用。,诊断试剂,1、诊断血清：中国CDC传控所呼吸道细菌室流脑组（北京昌平