基于以G-四链体DNA为靶点的isaindigotone类似物的设计与合成.doc

中山大学学士学位论文基于以g-四链体dna为靶点的isaindigotone类似物的设计与合成design and synthesis of isaindigotone derivatives targetingg-quadruplexes院系: 药学院专业: 药学学号: 05344143学位申请人: 薛丁导师姓名及职称: 黄志纾 教授中文摘要 目前癌症已成为仅次于心血管疾病的危害人类健康的第二大类疾病，在过去的几十年里人们对于癌症的治疗付出了不懈的努力，发展出了以放射治疗，化学药物治疗和手术治疗为主要手段的一系列治疗方法，在这些治疗手段当中，化学药物治疗一直是占据重要地位的治疗手段。开发具有高选择性，低毒性的化学治疗药物一直是人们努力达到的目标。随着近代生命科学的发展，肿瘤发生的本质和药物作用机制逐步得以揭示，大量新靶点的药物被发现并应用于临床治疗。在近年来，基于以g-四链体dna为靶点的抗肿瘤药物成为了人们关注的一个热点。由于g-四链体结构存在于基因组的一些重要位置，其中包括了端粒末端、部分癌基因、生长因子的表达调控区域等，与之相互作用的小分子配体便可以以诱导g-四链体结构的形成或改变其稳定性来达到抗肿瘤的目的。另一方面，目前临床上使用的dna烷化剂以及拓扑毒类药物，由于其与双螺旋dna的非特异性结合，会产生很大的毒副作用。因此设计具有高选择性的g-四链体小分子配体类的药物则将会成为十分具有前景的低毒性的抗肿瘤药物。 在本研究室的前期工作中，已合成得到了一系列新结构的靶向g-四链体的isaindigotone衍生物，它们的结构特征在于衍生物的相对柔韧性及非共平面性。研究结果表明化合物能特异性结合在g-四链体上而与双螺旋dna几乎没有作用。在此研究的基础上，本论文在原有化合物的基础上尝试进行了合理的结构改造，并最终得到了o-s1,o-s2,p-s1,p-s2 四个全新的化合物，并对合成的化合物通过esi-ms , 1hnmr手段进行了结构表征，同时对产率较低的母环中间体的合成进行了提高产率的尝试，对实验中出现的特殊情况进行了相应的分析和讨论。 关键词 癌症 g-四链体 端粒 端粒酶 isaindigotone abstract at the present time, cancer has become the most threatening disease to human being except for cardiovascular diseases. in the past tens of years, people have tried hard to improve the treatment of cancer, and have now developed a mode employing radiotherapy, chemotherapy and surgical therapy as the most commonly used treatments. as for chemotherapy, to develop a drug with high selectivity and low toxicity has become the aim of drug researchers. with the development of life sciences, the essence of tumor and interaction mechanism between drug and target were revealed, and lots of new targeting anti-tumor drugs have been developed and used in clinical chemotherapy. in recent years, drugs targeting at g-quadruplexes, which exists at many important regions, such as the telomere, promoter of some oncogenes has became one of heated research topics. small molecular ligands interacting with g-quadruplexes can achieve the aim of anti-tumor effects by means of promoting the formation of g-quadruplexes and stabilizing their structures. on the other hand, a major problem of those conventional anticancer agents is their significant toxicity because of their nonspecific interactions with the duplex dna, thus the development of new drugs act as selective g-quadruplexes ligands would be rather promising in reducing toxicity. recent studies of our laboratory have achieved the design and synthesis of a new series of flexible non-coplanar isaindigotone derivatives targeting at g-quardruplexes. fluorescence melting data revealed that the designed ligands bind tightly to g-quadruplex structure with discrimination against duplex dna. based on those results, rational modify was carried out on those compounds, and finally four compounds named o-s1,o-s2,p-s1,p-s2 were synthesized and their structures identified by esi-ms and 1hnmr. i also tried to improve the yields of the synthesis of heterocyclic stem nucleus and to analyze and discuss the problems encountered in my study. key words cancer g-quadruplexes telomere telomerase isaindigotone目录第1章 g-四链体dna及其生物学功能的研究进展61.1 引言61.2 g-四链体dna的结构61.2 g-四链体的生物学功能9第2章 以端粒g-四链体为靶点的小分子配体研究进展122.1 引言122.2 端粒及端粒酶122.2.1 端粒的结构及功能122.2.2 端粒酶的结构及功能142.3 端粒g-四链体及其小分子配体的设计152.3.1 端粒g-四链体结构152.3.2 端粒g-四链体与小分子配体的作用162.3.3 以端粒g-四链体为靶点的小分子配体17第3章 以端粒g-四链体为靶点的小分子配体：isaindigotone衍生物的设计与合成203.1 引言203.2 选题意义213.3 实验设计223.3.1 对于母环结构的改造223.3.2 母环的合成及其产率的改进223.3.3 路线i：两侧脲基侧链的isaindigotone衍生物的合成243.3.4 路线ii：一侧酰胺侧链的isaindigotone衍生物的合成253.4 结果及讨论263.5 实验部分293.5.1 仪器与试剂293.5.2 实验步骤29第1章 g-四链体dna及其生物学功能的研究进展1.1 引言普通意义上的dna是由两条互补链通过碱基配对的方式所形成的双链螺旋结构。随着人们对于dna研究的不断深入，人们认识到dna结构是以经典的b型双螺旋为主，但同时也存在有其他各种类型的结构形式。1962年，美国科学家 davies发现一条富含鸟嘌呤的dna短链，在一定条件下可以形成一种特殊的二级结构，即g-四链体(g-quadruplex) 1。这种dna的拓扑结构明显区别于watson和crick所发现的经典右手双螺旋dna(b-dna)。在人类的基因组中许多具有重要生物学功能的区域如端粒、免疫球蛋白开关区、基因启动子区以及与人类某些疾病有密切关系的序列均富含鸟嘌呤碱基，这样的一些基因组则被称为g-四链体家族（g-quadrome)，它们在细胞生长、增殖、凋亡、衰老及肿瘤的形成和发展过程中起着重要作用。在这些基因组中，g-四链体的形成可以对相应的生理过程产生调控作用，同时由于g-四链体拓扑结构的多样性，以及与普通双链结构上的显著差异，使其成为药物选择性识别的靶点。对于那些能够对细胞凋亡和肿瘤形成具有调控作用的基因组来说，这些部位诱导产生或是稳定g-四链体的化合物则可区别于目前临床上使用的非特异性结合dna的化疗药物而具有潜力成为具有高选择性及低毒性的抗肿瘤药物。1.2 g-四链体dna的结构g-四链体的基本结构是由被称作g-四分体(g-quartet)的基本结构单元堆积而成的，g-四分体是四个鸟嘌呤通过hoogsteen氢键组装形成的环状g-四分体结构，其中每个鸟嘌呤都作为氢键的供体和受体与相邻的碱基结合。g-四分体相互之间通过堆积形成具有四条链的g四链体，四条链之间形成四个沟槽，同时引入了不同数量和形式的loop，从而形成了g-四链体的基本结构，如图1-1 。图1-1 g-四链体的基本构成根据形成g-四分体结构的dna链来源不同，g-四链体可分为分子间和分子内两大类，根据它们的分子特性及螺旋取向，g一四链体又可具体分为如下几类： 含有鸟嘌呤重复序列的4个ttaggg单链所形成的分子问四链体即平行型(parallel)四链体。含有两个或多个鸟嘌呤重复序列 (ttaggg)n, n2的dna可形成gg发夹型(hairpin)，接着双分子化构成几种稳定的双分子四链体结构；具有4个或更长的鸟嘌呤重复序列(ttaggg)n, n2可以自身折叠形成分子内的四链体结构即自身折叠型(foldover)四链体2 。分子内g-四链体结构往往比较复杂。根据其形成的四链体拓扑特征被形象地命名为螺旋桨式(propeller-type)3、椅式4、篮式5、混合型(mixed-type 或 hybrid-type) 6, 7四链体。图1-2 各种不同类型的g-四链体结构a：分子间四聚体结构 (平行)；b：分子间邻位发夹型结构(反平行)；c：分子内椅状结构(反平行)； d：分子内蓝状结构(反平行)；e：分子内螺旋桨状结构 (平行)；f：分子内混合型结构同时，在四链体中不同的链的排布，因此产生了不同类型的loop，包括：propeller loop(螺旋桨式loop), lateral loop(侧面loop), diagonal loop(对角线loop)。在最近的分子动力学模拟研究中揭示：在g-四链体中，loop 序列是四链体柔韧性的主要贡献者，是药物配体潜在的结合位点8，如图1-3。 图1-3 四链体中各种不同类型的loop另一方面，g-四分体平面的八个羰基氧原子包围形成了一个强负电性的空穴，能够选择性地与某种金属离子进行配位，如k+，na+，sr2+9 ，被称作离子通道，如图1-4 。图1-4 g-四链体中的离子通道金属离子的类型对g-四链体拓扑结构也有重要的影响。最典型的例子就是人端粒富g 序列，它在na+离子的缓冲溶液中形成的是反平行的g-四链体10；而在k+离子的缓冲溶液中形成的却是混合型的g-四链体11。1.2 g-四链体的生物学功能研究发现，在真核生物基因组中，许多关键的调控区域都含有富g序列，并且具有形成g-四链体的可能性，比如免疫球蛋白的重链调控区（igg heavy chain switch region）、基因的启动子区域、核糖体dna（ribosomal dna）、微卫星片断（mini-satellites）和端粒末端等12,也就是上文中所述的g-四链体家族。它们的生物学功能如图1-5所示。图1-5 g-四链体的生物学功能 尽管在体外含有 g 重复序列的dna 在na+或k+的生理浓度下，很容易形成g-四链体结构,但在体内g-四链体的形成可能要复杂得多。究竟这些含有富g序列的基因组能否在体内形成g-四链体呢？现在科学家已经有许多证据证明：g-四链体在体内确实存在13，而且具有重要的生物学功能，研究表明，g-四链体结构在体内的生物功能实际是一个生物开关：富g dna形成稳定的g-四链体后，将抑制基因的转录和表达；dna的g-四链体解链后，将恢复基因的转录和表达功能。因此通过药物诱导或稳定例如c-myc、c-kit、bcl-2这样一些癌基因或是端粒末端基因的g-四链体则可以达到抑制癌基因表达和诱导癌细胞凋亡的效果，从而成为潜在的抗肿瘤药物开发靶点。1 gellert m., lipsett m. n., davies d. r. helix formation by guanylic acid. proc. natl. acad. sci. u.s.a., 1962, 48: 2013-2018.2 陆涛等.g一四链体dna：抗肿瘤药物的潜在靶点.药学进展,2001,25(2),65-69.3 parkinson g.n., lee m.p., neidle s., crystal structure of parallel quadruplexes from humantelomeric dna. nature, 2002, 417, 876-880.4 kelly j.a., feigon j., yeates t.o., reconciliation of the x-ray and nmr structures of thethrombin-binding aptamer d(ggttggtgtggttgg). j. mol. biol., 1996, 256, 417-422.5 smith f.w., feigon j., quadruplex structure of oxytrichatelomeric dna oligonucleotidesnature, 1992, 356, 164-168.6 phan a.t, patel d.j., two-repeat human telomeric d(tagggttagggt) sequence formsinterconverting parallel and anti-parallel g-quadruplexes in solution: distincttopologies,thermodynamic properties, and folding/unfolding kinetics. j. am. chem. soc, 2003, 125,15021-15027.7 wang y., patel d.j., solution structure of the human telomeric repeat dag3(t2ag3)3g-tetraplex. structure, 1993, 1, 263-282.8 hazel p., parkinson g. n., neidle s., predictive modelling of topology and loop variations indimeric dna quadruplex structures. nucleic acids res., 2006, 34, 2117-2127.9 juskowiak b., galezowska e., zawadzka a., gluszynska a., takenaka s., fluorescenceanisotropy and fret studies of g-quadruplex formation in presence of different cations.spectrochimica acta. part a., 2006, 64, 835-843.10 wang y., patel d.j., solution structure of the human telomeric repeat dag3(t2ag3)3g-tetraplex. structure, 1993, 1, 263-282.11 ambrus a., chen d., dai j., bialis t., jones r.a., yang d., human telomeric sequenceforms a hybrid-type intramolecular g-quadruplex structure with mixed parallel/anti-parallelstrands in potassium solution. nucleic acids res., 2006, 34, 2723-2735.12 burge s., parkinson g. n., hazel p., et al. quadruplex dna: sequence, topology and structure. nucleic acids res., 2006, 34(19): 5402-5415.13 maizels n., dynamic roles for g4 dna in the biology of eukaryotic cells. nat. struct. mol.biol., 2006, 13: 1055-1059.第2章 以端粒g-四链体为靶点的小分子配体研究进展2.1 引言 端粒是由染色体末端dna和端粒结合蛋白组成的复合物。它具有维持维持染色体稳定性和完整性，防止染色体发生降解、融合、重组和丢失，保持遗传系统的稳定性的重要功能。同时研究也表明它对于细胞的凋亡，衰老和死亡具有重要的调控作用，每经历一次细胞分裂，端粒的长度就缩短一些1。端粒酶则是是一种由rna 和蛋白质组成的核糖核蛋白复合体，具有逆转录酶的活性。它以其自身rna为模板逆转录合成端粒dna序列并添加至端粒末端，以维持端粒长度。由于端粒基因组是属于g-四链体家族的具有重复序列的基因片段，因此具有形成g-四链体的能力，针对端粒g-四链体为靶点的小分子配体则成为了目前研究的热点。2.2 端粒及端粒酶2.2.1 端粒的结构及功能 端粒的主要组成部分是端粒dna和端粒结合蛋白，人端粒dna是由富含鸟嘌呤的重复序列dttagggn（n 200）组成的，而端粒结合蛋白则包括了保卫蛋白复合体（telosome 或者shelterin）及非保卫蛋白。端粒dna的末端是由一段具有一段被称为g-单链悬垂（g-overhang）的单链结构。这段单链结构则是以一种被称为“t环”的结构存在的。griffith jd 等证实t环是端粒3单链伸入到端粒双链ttaggg 重复序列后形成的，同时在其伸入处置换出一段与自身序列相同的单链后，与互补链配对形成d环 ( displacement loop ) 结构2 ，如图2-1。端粒正是借助这种“保守”的空间结构来完成其保护染色体的功能，如防止染色体间的错误重组、末端融合、保护染色体免于被化学修饰或被核酶降解等。图2-1 人端粒结构示意图相关的结合蛋白则包括了端粒重复因子1 ( telomeric repeat factor 1，trf1)，端粒重复因子2 ( telomeric repeat factor 2，trf2)，trf1交互作用核蛋白2 (trf1-interactingnuclear protein 2，tin2)，端锚聚合酶( trf-interacting ankyrinrelated adp-ribosepolymerase，tankyrase )，人转录激活蛋白 ( human repressor-activator protein 1，hrap1)，端粒保护蛋白( protection of telomere，pot1) 和ku蛋白。这些结合蛋白调节着端粒的功能，其中trf1是端粒长度调节因子，主要负责调节端粒的长度，控制端粒的延伸，它的过度表达可以使端粒长度逐渐缩短。trf2蛋白则主要负责保护染色体的末端，招募rap1蛋白和mre11修复蛋白复合物到端粒处。trf2丢失将会导致染色体末端失去保护，造成染色体末端与末端融合。pot1的作用则涉及调控端粒酶的活性。它们的结构如图2-2所示。图2-2 处于不同状态下的端粒及其相关结合蛋白2.2.2 端粒酶的结构及功能 端粒酶是1985 年由blackburn 等在四膜虫细胞核提取物中首先发现并纯化的，随后在人的hela 细胞等细胞中得到证实3。目前研究认为端粒酶主要包括人端粒酶rna (human telomere rna，htr)、端粒酶相关蛋白 (human telomerase protein，htp) 和人端粒酶逆转录酶 (human telomerase reverse transcriptase，htert)这样几个组分，在最近的研究中又发现一种叫做tcab1 (telomerase cajal body protein 1)的新组分4。端粒酶的主要功能是合成染色体末端的端粒，以维持端粒长度的稳定性。端粒dna 的合成必须依赖端粒酶中的rna为模板，以端粒3 末端为引物，依靠逆转录机制合成端粒重复序列ttaggg,逆转录合成的dna则被添加至端粒末端从而使端粒延长，如图2-3。图2-3端粒酶延长端粒dna的过程端粒酶在胚胎发育期的活性很高，而在成熟体细胞中端粒酶的活性则会被关闭，以此来调控细胞的生长、分化和衰老。由于端粒酶对于端粒的延长阻止了细胞的正常凋亡，因此一般认为端粒酶的表达和肿瘤细胞的产生具有不可分割的关系。根据目前已经检测出的肿瘤组织标本的统计学分析，恶性肿瘤组织端粒酶活性的阳性率达到84%95%，而良性肿瘤和正常组织的端粒酶活性检出率仅为4%左右5，这一研究结果也证实了这点。因此对于端粒酶表达的阻止也成为了目前受关注的抗肿瘤药物研究靶点。2.3 端粒g-四链体及其小分子配体的设计2.3.1 端粒g-四链体结构属于g-四链体家族的人端粒dna是由富含鸟嘌呤的重复序列dttagggn（n 200）组成的，因此具有形成g-四链体的能力，尽管对在生理学条件下形成的分子内g-四链体的准确构型仍然存在争议，但在体外形成的分子内g-四链体的结构得到准确的表征。在不同的孵育条件下，形成的两种人端粒分子内g-四链体dna 结构已经被确切地鉴定出来。其中一种是在na+缓冲溶液中孵育形成的，通过nmr 波谱研究检测，证实为反平行的篮式g-四链体拓扑结构6，该结构包含有序列为tta 的lateral loop 和diagonal loop 。另一个是与k+络合得到的晶体结构，为分子内的平行型螺旋桨式四链体7。因为在k+溶液中的g四链体结构被认为是最接近体内真实情况的，所以，关于端粒分子内g四链体在k+溶液中的折叠模式和分子结构性质的研究工作被广泛开展。最近在k+离子溶液中又发现8,9第三类构型：混合型的g-四链体。2.3.2 端粒g-四链体与小分子配体的作用研究发现，在端粒酶以逆转录机制延长端粒末端的过程中，端粒dna可能短暂地折叠成g-四链体结构，从而提供牵引力以帮助dna底物和rna模板分离，向3方向移动一个重复序列，然后在端粒dna和端粒酶rna重新配对进行下一个延长循环之前，g-四链体又展开为单链。因此小分子配体可以通过诱导或捕获g-四链体结构，稳定其存在，从而使端粒延长过程产生周期性停顿。同时端粒形成的g-四链体阻止了端粒酶对端粒dna引物的识别，从而也抑制了端粒酶活性。同时由于g-四链体相对于双链dna的结构差异，设计选择性诱导或是稳定端粒g-四链体的小分子配体则可以通过抑制端粒酶的作用而发挥抗肿瘤作用。研究表明，小分子配体和不同结构的g-四链体结合模式不同。分子模拟显示，配体可以非共价键结合形式堆积在末端g-四分体上，结合在沟上、环上或插入两个g-四分体平面之间。其作用力主要包括了堆积，静电作用和氢键作用等。其结合模式主要分为两种：外部堆积模式和插入模式。从实验数据和能量分析来看，外部堆积模式是复合物最有可能的一种结合方式。2.3.3 以端粒g-四链体为靶点的小分子配体目前已发现的端粒g-四链体的小分子配体多达十多种，例如二酰胺蒽醌/芴酮类，如图2-4所示：图2-4 bsu1051 1997年, sun等10报道了第一个以g-四链体为靶点的小分子端粒酶抑制剂2, 6-二酰胺蒽醌衍生物bsu 1051。该化合物能够稳定g-四链体结构, 对端粒酶活性有抑制作用。其中一些化合物的ic50值达到1 5mol/l,具有很高的活性, 但由于其能与双链dna作用, 选择性较低，因此细胞毒性较高，限制了其发展。 阳离子型卟啉类化合物是另一类研究得比较多的小分子端粒g-四链体配体，由于卟啉类化合物在肿瘤组织中能积蓄达到较高的浓度, 而在正常组织中却很快代谢, 长期以来, 它们在肿瘤治疗方面倍受关注11。图2-5 tmpyp4如图2-5所示，卟啉具有芳香环平面结构，可通过与g-四分体相互堆积，从而结合到g-四链体上，从而可以通过稳定端粒g-四链体而达到抑制端粒酶的作用。如图所示为tmpyp4四(n -甲基吡啶-2-基)卟啉,它具有典型对称的大环芳香平面，被作为特殊的分子探针广泛地用于研究各种不同靶点不同序列的g-四链体。苝类化合物是应用计算机辅助药物设计获得的一类与人端粒g-四链体有较强相互作用的化合物。在计算机设计的基础上，fedo roff等12合成了n ,n-双2-(1-哌啶基)乙基-3, 4, 9, 10-四甲酰二亚胺(piper)，如图2-6所示：图2-6 piperhan等13的研究发现, piper 使发夹型双分子g-四链体的形成速度提高了约100倍, 这说明了它不仅能够稳定已形成的g-四链体，同时还能够诱导其形成，同时研究表明它也能够抑制sgs1解旋酶对g-四链体的解旋14，进一步稳定了g-四链体的存在。除此以外，还有包括吖啶类，端粒抑素类，氟代喹诺吩噁嗪类,二价镍配合物, 小檗碱类衍生物等一系列化合物均可作为g-四链体的小分子配体。对于大部分小分子配体来说，它们主要是都具有一个与g-四分体大小或形状类似的延展的平面芳香环结构或缺电子发色团通过堆积和静电作用而结合在四链体最外部的g-四分体，同时通过侧链上的阳离子取代基等通过氢键和静电力等作用力与四链体的沟槽和凸环相互作用而加强与之的结合能力。这样一些特征都是在设计靶向g-四链体的小分子配体时所需要考虑的。1 blackburn e. h. swithching and signaling at the telomere. cell, 2001, 106, 661-673. 2 griffith j. d , comeau l , rosenfield s , et al. mammalian telomeres end in a large duplexloop. cell , 1999 , 97 (4) : 503-514.3 greider c. w., blackburn e. h. identification of a specific telomere terminal transferaseactivity in tetrahymena extracts. cell, 1985, 43, 405-413.4 andrew s. venteicher, steven e. artandi, et al. a human telomerase holoenzyme protein required for cajal body localization and telomere synthesis. science，2009, 323(5914), 644 648.5 shay j. w., bacchetti s. a survey of telomerase activity in human cancer. eur. j. cancer, 1997, 33(5): 787-791.6 wang y., patel d. j. solution structure of the human telomeric repeat repeat ag3(t2ag3)3g-tetraplex. structure, 1993, 1, 263-282.7 parkinson g. n., lee m. p., neidle s. crystal structure of parallel quadruplexes from humantelomeric dna. nature, 2002, 417, 876-880.8 ambrus a, chen d, dai j, bialis t, jones ra, et al. human telomeric sequence forms ahybrid-type intramolecular g-quadruplex structure with mixed parallel/antiparallel strands inpotassium solution. nucleic acids res, 2006, 34:2723-2735.9 luu k n, phan a t, kuryavyi v, lacroix l, patel d j. structure of the human telomere ink(+) solution: an intramolecular (3+1) g-quadruplex scaffold. j am chem soc, 2006, 128:9963-9970.10 d sun, b thomp son, b e cathers et al. j. m ed. chem. , 1997, 40: 2113-2116.11 殷菲,刘建辉,彭孝军.以g-四链体为靶点的小分子端粒酶抑制剂研究进展.化学通报2004,4:271-277 12 o y fedo roff, m salazar, h han. biochem istry, 1998, 37: 12367-12374.63 han h., cliff c. l., hurley l. h. accelerated assembly of g-quadruplex structures by a smallmolecule. biochemistry, 1999, 38, 6981-6986.14 han h., bennett r. j., hurley l. h. inhibition of unwinding of g-quadruplex structures bysgs1 helicase in the presence of n,n-bis2-(1-piperidino)ethyl-3,4,9,10-perylenetetracarboxylic diimide, a g-quadruplex-interactive ligand. biochemistry, 2000, 39, 9311-9316.第3章 以端粒g-四链体为靶点的小分子配体：isaindigotone衍生物的设计与合成3.1 引言设计具有诱导或稳定端粒g-四链体的小分子配体，可以通过特异性抑制端粒酶的活性来达到抑制肿瘤细胞的目的。如何设计具有高选择性并具有低毒性的g-四链体的小分子配体是目前人们研究的重点。从天然产物中发现具有特性的小分子并进行结构改造是目前新药发现的一个重要途径，isaindigotone是一类从板蓝根中提取得到的天然产物，与之结构类似的还包括从骆驼蓬属植物中提取得到的去氧鸭嘴花酮碱类活性生物碱，它们一般具有广泛的生物学活性，包括：抗炎、抗菌、抗抑郁等。目前对于isaindigotone的改造及生物活性研究较少，一般的研究认为它具有一定的抗炎作用1。 图3-1 isaindigotone的结构作为喹唑酮生物碱的isaindigotone具有一个平面芳香环的母体结构以及一个柔性的取代苯基侧链，如图3-1。它的衍生物结构上的相对柔韧性使其能更好的适应不同结构g-四链体上不同的结构单元，并同时由于其不符合双螺旋dna嵌入剂的特征，因而具有特异性识别g-四链体的功能，因此通过在其基础上根据其与g-四链体的结合模式进行结构改造，便有希望获得具有高活性及高选择性的g-四链体小分子配体。3.2 选题意义在本实验室谭嘉恒博士的前期工作中设计并合成了一系列新结构的靶向g-四链体的isaindigotone衍生物，它们的结构特征在于衍生物的相对柔韧性及非共平面性。研究结果表明化合物能特异性结合在g-四链体上而与双螺旋dna几乎没有作用。圆二色光谱以及凝胶阻滞实验则表明，在钾离子存在的溶液状态下，衍生物可以改变端粒序列原来占主导地位的混合式g-四链体构象，而选择性稳定分子内正平行（螺旋桨式）的结构。可以通过进一步结构修饰，得到高活性和高选择性的g-四链体配体2。在此实验结果的基础上，本人对于该系列衍生物尝试进行了一些合理的结构改造，在通过增加氢键供体，减小分子量以提高成药性，以及改善母环中间体的产率方面进行了一系列研究。3.3 实验设计3.3.1 对于母环结构的改造 图3-2 母环结构的改造在实验室前期工作合成的isaindigotone类似物的基本结构如图3-2a所示，其母环为一个喹唑酮并吡咯环的非平面结构，在其两边各有一条柔韧的氨基侧链。我们尝试将其中的吡咯环（a环）改造成为哌啶环（b环），如图3-2b所示。通过环系的扩大，使得环上的侧链与母核之间的角度降低，通过之前对于g-四分体结构及该类小分子与之结合模式的研究，这样的改造有利于其分子结构与g-四分体平面以更适合的角度结合，在此结构基础的上的结构改造则有希望得到具有更好结合能力的g-四链体小分子配体。3.3.2 母环的合成及其产率的改进图3-3 母环的合成整个系列化合物的母核的合成方法如上图所示，2-氨基-4-硝基苯甲酸与吡咯烷酮或哌啶酮在三氯氧磷的作用下进行关环反应，从而得到产物o1及p1。其反应分析如图34：图3-4 母环合成分析吡咯烷酮在三氯氧磷的作用下首先形成含亚胺的氯代中间体，该中间体非常活泼，随机与取代的邻氨基苯甲酸发生关环反应，形成取代的吡咯喹唑酮母体。 在实验室前期的实验过程中，该关环反应的产率很低，仅约为15-20%，因此在查阅文献的基础上，尝试改进合成的方法来提高产率：i 改变合成方法：图3-5 改进后的合成方法在之前的合成方法中，邻氨基苯甲酸结构中的羧基由于收到苯环的共轭作用，其与哌啶酮中的氨基发生亲核取代的反应活性降低，可能是造成反应产率不够高的一个原因，在此路线中首先采用了二氯亚砜与羧基作用得到酰氯，同时使氨基转化成为异氰酸酯结构，从而得到一个活泼的反应中间体，它再与哌啶酮发生关环反应即得到母核产物。据文献报道采用此方法合成的类似物无需经过柱层析，仅需使用碳酸钾溶液洗丙干燥并重结晶即可得到产品，我们也希望能通过此途径简化我们之前方法中柱层析的后处理步骤。ii 微波合成法首先将反应物以溶剂溶解后与硅胶拌样后，在微波照射下发生固相合成反应。相比普通的回流合成法，该方法反应所需的时间很短，而且一般产率相对较高，在我的研究过程中对此也进行了适当的尝试。3.3.3 路线i：两侧脲基侧链的isaindigotone衍生物的合成图3-6 两侧脲基侧链的isaindigotone衍生物的合成路线合成路线如图，首先具有邻氨基苯甲酸结构的o1/p1与哌啶酮在三氯氧磷的作用下进行关环反应，得到o2/p2，o2/p2再与对硝基苯甲醛在醋酸钠的催化下通过缩合反应得到o3/p3，o3/p3在乙醇和水回流的条件下被na2s还原得到o4/p4，接着再与三光气在低温下，在三乙胺催化的条件下得到活泼的具有异氰酸酯结构的中间体o4/p4，再与小分子的n,n-二甲基-1,3-丙二胺反应得到最终产物o5/p5。该路线最终力求得到含有两侧脲结构侧链的衍生物，相比实验室之前工作中得到的两侧酰胺侧链结构的产物，该化合物在结构上具有更多的氢键供体和受体，通过之前的构效关系研究，我们希望此类化合物能够与g-四链体的沟槽结构有更好的结合能力，从而增加整个化合物对于g-四链体的特异性的识别和稳定作用。3.3.4 路线ii：一侧酰胺侧链的isaindigotone衍生物的合成图3-7 一侧酰胺侧链的isaindigotone衍生物的合成路线其中f-h三步的合成与路线i相同，在i这一步中，使用氯丙酰氯作为反应溶剂，在o7/p7共同回流的条件下得到带有酰氯侧链的化合物，接下来o7/p7在nai催化的条件下在乙醇中与小分子的胺吡咯烷和哌啶发生反应得到最终产物o-s1/p-s1, o-s2/p-s2。该路线最终力求得到一侧具有酰胺结构侧链的产品，在实验室前期工作中所得到的isaindigotone衍生物中，一般具有两侧酰胺结构的侧链，但往往分子量较大，成药性相对较低，而我们所合成的一侧酰胺侧链的化合物根据之前的构效关系研究，很可能在活性上会有所降低，但由于其具有更小的分子量，因此具有更好的成药性，因此我们也希望通过后续的研究，验证这一结果。3.4 结果及讨论在路线i中，我主要负责o2-o5这一系列化合物的合成（即由o1衍生化得到的系列化合物）。实验中首先首先得到了具有六元哌啶环结构的母核化合物，反应采用的溶剂为无水的甲苯，并采用了机械搅拌的方法。相比另一系列化合物的合成，反应结束后2位硝基的产物(o2)一般大部分会从反应体系中析出，而3位硝基的产物(o3)则不会，分析知可能是由于两种产物的极性差异而使得其在低极性的甲苯中溶解性的差异所造成的。反应结束后将反应液倒入冰水中调节ph到碱性，以除去未反应完全的邻氨基苯甲酸并使反应过程中由于酸性环境而成盐的产品由水相中置换出来。最终将固体及有机相部分合并后经柱层析及重结晶纯化后得到淡黄色易溶于丙酮的固体，在254nm紫外灯下呈现紫红色荧光。初期反应我们采用了如图3-3所示的关环反应，在投料比上参照了之前合成具有五元吡咯烷结构母核的反应，其中o1相对于哌啶过量。但反应结果显示产率很低，约仅为15-20%，因此我们考虑尝试采用文献报道的另一种反应方式来提高产率，如图3-5所示。反应分为两步进行，在投料比方面哌啶酮约为1.2e.q.，相对o1过量。在后处理方面，反应结束后得到的固体尝试了几种有机溶剂均难以溶解拌样，勉强部分溶解后尝试进行重结晶，效果并不理想，最终勉强将大部分固体溶解和溶解于反应液中的部分合并拌样并通过纯化得到产品，最终产率约为17%，相比之前的方法并没有明显提高。分析可能是由于我们所合成的化合物中硝基等极性基团的存在改变了其溶解性质等原因造成的，也有可能是由于反应中的溶剂不够干燥而造成反应中的活泼中间体部分分解所造成。新方法在实际反应中并未带来产率的提高，但它哌啶酮相对过量的投料比给了我们启发，由于之前我们普遍采用了并不必要的5位邻氨基苯甲酸(o1)过量至两倍的投料比，因此我们尝试采用新方法中所用到的投料比，采用原来的反应方法进行反应，反应结果得到大量未纯化的粗产品，但尝试了重结晶及柱层析均较之前难以纯化，由于考虑到下一步反应中产品不溶于乙酸及丙酮等溶剂中，而第一步的粗产品易溶于丙酮，因此考虑对第一步产品不进一步纯化直接尝试进行下一步反应。在b反应中，产品o3在反应中呈黄色固体析出，用丙酮洗涤并干燥后即得淡黄色的固体产品，并得到了核磁的验证。由于采用的是含有杂质的原料，因此我们得到的为粗产率，达到了75%，而两步的合并产率也达到了约43%，相比之前有非常大的提高，分析知可能是由于采用哌啶酮过量的投料比使得反应过程中的活化中间体浓度大大增加，使得原料能够充分参与反应，从而大大提高了产率。对于反应a，我们也尝试了微波反应的方法，反应中采用丙酮溶解反应物并使用旋转蒸发仪拌样，在功率700w，温度100的条件下，反应5-10min，几