高效液相色谱补充内容.ppt

第八章 HPLC的补充内容,液相色谱键合相的类型和色谱性质的主要影响因素,高效液相色谱键合固定相的类型,主要有四类： 硅-氧-碳键型固定相 硅-氮-碳键型固定相 硅-氧-硅-碳键型固定相 硅-碳键型固定相,1、硅-氧-碳键型固定相 制备方法之一： 高压、过量醇、280度条件下与硅胶的硅羟基发生反应。 制备方法之二： 亚硫酰氯处理硅胶获得表面氯化硅胶，再与过量醇进行醇解反应。 缺点：容易被水解,2、硅-氮-碳键型固定相 制备方法： 先将硅胶表面氯化，再使伯胺与氯化硅胶反应。 对有机溶剂和pH=3-8的水介质稳定。,3、硅-氧-硅-碳键型固定相 制备方法： 硅胶表面的硅羟基与有机氯硅烷或有机硅氧烷进行硅烷化反应 。 对有机溶剂和pH=2-8.5的水介质是稳定的。,4、硅-碳键型固定相 制备方法： 氯化硅胶和有机锂或格氏试剂反应。 稳定性优于硅-氧-碳键型固定相，但生成的产物覆盖度较低。,键合固定相的性质,1、表面覆盖度 完全水解的硅胶表面有8umol/m2硅羟基，由于位阻的存在只有约一半的硅羟基可以进行反应。 好的填料要把残余硅羟基掩蔽起来，利用掩蔽试剂与参与硅羟基反应，以消除其不良影响。 表面覆盖度越高，色谱保留越强。,2、键合相链长的影响 对于反相色谱固定相 键合相链长越长保留越强 对于正相色谱固定相 链长的影响不明显。 3、键合固定相基质性质的影响 基质的种类、表面积、化学性质影响键合量、覆盖度等，都会对键合相有一定的影响。,高效液相色谱的色谱柱和流动相,色谱柱,HPLC柱填料 1、全多孔球形硅胶填料最为普遍 硅胶基质分为微孔(小于2nm)，中孔(2-50nm)，大孔(大于50nm)硅胶，多用中孔和大孔硅胶填料 2、其它金属氧化物基质填料 TiO2、Zr O2、高分子聚合物等基质的填料，能够改善耐碱性和减弱硅羟基效应。,硅胶色谱柱填料的优势 硅胶有良好的机械强度 硅胶的孔结构和比表面积容易控制 硅胶填料具有比较好的化学稳定性和热稳定性 硅胶表面具有丰富的硅羟基，可以进行化学键合修饰,硅胶色谱柱填料的残余硅羟基效应 碱性分析物严重拖尾，分离度低。,加入碱性流动相 添加剂抑制,反相色谱柱填料保留性能随温度的变化,lnk与1/T在一定温度范围内呈线性关系,提高硅胶基质反相色谱填料的色谱性能 提纯硅胶，利用高纯(99.999%)硅胶色谱填料 对硅胶进行充分封端（尾） 利用空间位阻掩蔽残余硅羟基 键合相分子中嵌入极性基团（胺基、脲基、酰胺基） 双齿键合相,高效液相色谱的流动相,常用反相色谱流动相：甲醇-水、乙腈-水 常用正相色谱流动相：正己烷-异丙醇、正己烷-乙醇、正己烷-四氢呋喃 常用离子色谱流动相：稀硝酸、稀氢氧化钠 需要考虑流动相自身中紫外检测波长下的吸收强弱，溶剂紫外截止波长见表9-4。,高效液相色谱方法的选择,反相色谱可以分析多数样品。 极性极强的水溶性样品在反相色谱中保留很弱，难以有效分离，可以用正相色谱（氨基柱、二醇基柱）有机溶剂-水流动相分离。 弱酸、弱碱样品抑制电离，反相分离。 分析离子，首选离子色谱。 生物分子的分离模式有反相、离子交换、体积排阻、疏水作用、亲和色谱模式。,色谱条件的影响,色谱柱影响分离度，越长分离度越大，内径越小分离度越高。 柱填料影响分离度，颗粒越小柱效越高，分离度越大，但柱压越高（5m到3m柱效提高30%柱压却升高1倍）。 流动相影响保留，洗脱能力越强，分析时间越短，如：反相色谱流动相中有机组分增加保留减弱。 流速越高，保留时间越短，但柱压液越高。 柱温越高，保留时间越短，分离度有所降低。 在等度洗脱难以获得短的分析时间和满意色谱峰形时，可以进行梯度洗脱。,40度 169bar,90度 94bar,温度的影响,SB-C8 4.6X75mm 3.5um 流通池: 5mm, 2.5uL 2060%B (10min.) 2mL/min.,SB-C8 4.6X150mm 5um 流通池: 10mm, 8uL 2060%B (30min.) 1mL/min.,填料粒径的影响,5um 色谱柱尺寸: 4.6 x 50mm,3.5um 色谱柱尺寸: 4.6 x 50mm,填料粒径的影响,-CN柱,-苯基柱,C8柱,填料种类的影响,液相色谱仪器的维护,液相色谱仪器的维护和维修,流动相需要用0.45m的微孔滤膜进行过滤,微孔滤膜,滤膜种类分为过水相和过有机相两种,过滤有机相流动相用有机（聚四氟乙烯）滤膜。 过滤水或盐溶液作为流动相用水相滤膜。 盐溶液作为流动相时，需要先将盐溶解后再进行过滤，不能先过滤完水再溶解盐，防止盐中的固体不溶物堵塞流路。 注意：用于过滤无机流动相的滤膜溶于有机溶剂。,样品需要用0.22m的微孔滤膜进行过滤,样品需要用0.22m的微孔滤膜进行过滤,针式样品过滤器,流动相中的固体颗粒和密封圈碎屑会堵塞过滤白头，导致泵压过高，需要及时更换。,安捷伦液相色谱仪更换过滤白头,密封圈老化、磨碎，导致漏液,检测器的维护一 氘灯（寿命2000h左右，价格5000-6000元） 不宜频繁开关 开+关=4小时 需要用时才开，不使用时最好关闭 冲柱（平衡或冲洗）时可以不接检测器 一是节省灯的使用，二是防止污染检测器 多数仪器的检测器电源开关在开机时就已打开，但灯的开关并没有开。,检测器的维护二 不用时充满有机流动相，如甲醇，乙腈等。 长时间未用在开始使用时检测器内可能会有气泡，现象是检测信号呈锯齿状剧烈大幅度波动，解决方法是快速堵住和放开检测器的出液口，堵住时使其内部压力瞬间增大放开后气泡会被冲出。 检测器（连有进出液两管）被堵，先检查是否是进液管被堵（多数情况下它被堵），用小流速倒冲，出液管连接泵。,色谱柱的维护 色谱柱的保存参考购买色谱柱的说明书，一般反相色谱柱（C18，C8等）用色谱纯甲醇或乙腈充满后用堵头密封两头冰箱内保存。 色谱柱在开始使用时（或使用完毕时），用洗脱能力强的流动相冲洗，除去上次使用时（或本次使用时）残留在固定相上的样品污染物等。 色谱柱冲洗过程中最好不接检测器，防止污染了检测器。 色谱柱使用多次后（出现柱压高、柱效低等）参考说明书冲洗再生。,色谱柱的正确连接,尽量减小缝隙，以减小死体积，减小色谱峰的展宽,常见商品反相色谱键合固定相,键合相稳定性取决于键合技术,流动相中有机组分 含量高时,流动相中有机组分 含量低时,传统的键合和封端（封尾）,固定相键合 二甲基硅烷,封端 三甲基氯硅烷,流动相pH低于2的环境中 传统的键合相分子容易水解而流失，造成色谱柱损伤，具体表现为保留减弱和残余硅羟基效应。,侧链位阻基团大的键合相分子 可以提高酸性条件下的稳定性,无封端,双封端,三封端,双齿 双封端,如何查阅色谱柱说明书,主要依据色谱柱及填料参数,色谱柱参数,基质类型 粒径大小 孔径大小 碳含量高低 封尾类型 色谱柱内径 色谱柱长度,超高效液相色谱（UPLC）,UPLC和快速液相色谱,仪器方面代表性的是2004年Waters公司推出Aquity 超高效液相色谱(UPLC)，Agilent公司 从2006年相继推出Agilent 1200、1260、1290具有更高耐压限和灵活性的高分离度快速液相色谱系统（RRLC）。 色谱柱方面在市场上出现了不同规格、不同品牌的亚2m（1.7m）的色谱柱，及性能和工作范围各不相同的超高效液相色谱产品。,使用亚2微米粒径的色谱柱，用Agilent 1200系列高分离度快速液相色谱（RRLC）系统进行快速和超快速分析,UPLC,超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography UPLC）是分离科学中的一个全新类别，UPLC借助于HPLC（高效液相色法）的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。超高效液相色谱是一个新兴的领域，作为世界第一个商品化UPLC产品的Waters ACQUITY UPLCTM 超高效液相色谱系统在1996年问世，之后像安捷伦、岛津等公司也陆续开始生产超高效色谱仪。目前，超高效液相色谱仪已经开始逐渐地投入液相实验中。,Agilent 1290 液相色谱系统,UPLC的原理与HPLC相同，所改变的地方主要有以下几点： 小颗粒、高性能微粒固定相的出现。HPLC色谱柱，例如常见的十八烷基硅胶键合柱，它的粒径是5um，而UPLC的色谱柱，会达到3.5um，甚至1.7um，具有更高柱效，更加利于物质分离。 超高压输液泵的使用。由于使用的色谱柱粒径减小，使用时所产生的压力也自然成倍增大。故液相色谱的输液泵也相应改变成超高压的输液泵。,高速采样速度的灵敏检测器。 与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍，它缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量降低了分析成本。,UPLC比HPLC更为优越，主要表现为更高效的分离效率，即分析时间更短和分离度更大。,制备色谱,制备色谱是能够获得一定量（从几毫克到千克甚至吨级）纯品的色谱分离方法。 制备色谱在医药工业（如外消旋体药物分子的分离），生化技术（生物制品的纯化和植物化学组分的纯化），精细化学品的生产方面已成为越来越重要的制备分离手段。很多高纯标样只能用制备色谱获得。 为了满足生物、中药等复杂体系分离纯化的任务，制备色谱越发发挥出其作用。,制备型液相色谱技术可以简单的认为是分析型液相色谱技术的放大，一是输液泵有高的流量，二是所用的色谱柱有大的直径和柱填料有大的粒径，三是大的进样量，四是可以获得纯品。 分析型色谱注重的是分离度和分离速度，而制备色谱以获得纯品为唯一目的，在牺牲分离度和分析速度的前提下获得纯品。,制备型与分析型液相色谱的异同,分析色谱目的分析样品，制备色谱以获得纯品为目的 分析型色谱进样量小够检即可，制备色谱进样量尽可能大。 分析色谱柱内径1-5mm，制备色谱柱1-10cm甚至更大 分析柱填料7m。 分析色谱流速 10mL/min 分析色谱检测器可以破坏样品（如电化学检测器），制备色谱检测器不能对样品造成破坏。 分析色谱流动相不需要易挥发，制备色谱流动相必须具有挥发性，才利于蒸干获得样品组分的纯品。,表14-2,制备色谱根据制备量的高低分为半制备、制备和工业制备三大类，所用色谱柱规格也是越来越大，制备色谱柱价格昂贵，从几千到几万甚至几十万。 经典的制备色谱多用大粒径的硅胶填装玻璃柱作为制备色谱柱，用正己烷-二氯甲烷等正相色谱流动相作为淋洗液制备分离纯化样品组分，方法成本较低，但是效率低。 自动化的制备色谱仪连接高分