《有机酸发酵》PPT课件.ppt

第三章 有 机 酸 发 酵,有机酸发酵工业是生物工程领域中的一个至要且较为成熟的分支，在世界经济发展中，占有一定的地位。有机酸在传统发酵食品小早已得到广泛应用。以微生物发酵法生产且达工业生产规模的产品已达十几种。 用微生物发酵法生产有机酸，以代替从水果和蔬菜等植物中提取有机酸，是近年来由于社会及市场的需要而开发出的方法。由于食品、医药、化学合成等工业的发展，有机酸需求骤增，发酵生产有机酸逐渐发展成为近代重要的工业领域。,我国是世界上最早利用和发酵生产有机酸的国家之一，由于有机酸发酵是生物体内的基本代谢过程，又和人民群众的生活密切相关，近40年来，有机酸工业从无到有，尤其是近20年出现了蓬勃发展的趋势。 柠檬酸和乳酸系列产品已进入国际市场，从质量及产量两方面皆具有较强的市场竞争能力；苹果酸和衣康酸已进入市场开发和大规模生产；葡萄糖酸的发酵生产已进入成熟阶段；其他新型有机酸产品的研究开发正受到国家和相关企业的高度重视、新产品和新用途将会层出不穷。,众多有机酸发酵产品中，就日前市场占有率而言，其规模和发展速度仍以柠橡酸为最，它占酸味剂市场的70左右。同时聚乳酸(PLA)塑料的问世，使L乳酸的应用领域扩大到化工、环保等方面，因而，L-乳酸的发展前景喜人。 有机酸发酵工业，它的价值不在于产量本身产生的产值，而在于它所创造的社会效益。 我国发酵有机酸除醋酸外基本上都是解放以后发展起来的新兴产业，品种较全。据粗略统计，我国发酵有机酸的生产能力为278万ta，实际产量为220万ta(表21)，估算产值为39亿元。主要有机酸都以出口为主，但也有少量进口,柠檬酸发酵,柠檬酸是生物有机体三羧酸循环的中间代谢产物之一，广泛存在于各种生物体中，特别是柠檬、柑橘、菠萝、李、梅、桃、大花果等果实中含量较高，某些植物的叶子，如烟叶、棉叶，以及动物肌肉、骨骼、乳汁、唾液、汗、尿中也存在柠檬酸；,柠檬酸(citric acid)，又名枸橼酸，学名为2羟丙烷三羧酸(2-hydroxytricarboxylic acid或2羟基丙烷1，2，3三羧酸(2hydroxypropane-1，2，3-tricarboxylic acid)柠檬酸的分子C6H8O7，相对分子质量为192.13。结构式为,异柠檬酸是柠檬酸的同分异构体，它的羟基在2位C上。,物化性质 无色半透明晶体或粉末，无臭味，有强酸味。含有一水结晶物，在干燥空气中易风化。易溶于水和乙醇，溶于乙醚，无毒。相对密度为1542，熔点153(无水品)。 柠檬酸有两种形式存在：一种为有光泽的含有一个结晶水的柠檬酸，一般常以此种形式出售：另一种为无水柠檬酸，可防止长途远输和贮存结块。 质量标准：外销应符合英国药典Bp80；内销应符合国家食品添加剂标准(GB80)。,英国药典标准 (1)形状：无色结晶或白色结晶粉末； (2)溶解度：溶于1份水或15份乙醇(96),微溶于乙醚; (3)重金属：不超过10mgkg(以Pb计)； (4)铁：不超过50 mgkg (5)氧化物：不超过mgkg (6)草酸盐：不超过500mgkg； (7)水分：无水物不超过1。，水合物不超过9 (8)硫酸灰分：不超过o； (9)含量：不低于995，不高于101。,主要技术指标 产酸率：发酵液含柠檬酸160180g/L 糖转化宰：90 发酵周期：5天以内 收率：70以上,2主要用途 柠檬酸用途很广，因其无毒，水溶性好，酸味适度，易被吸收和价格较低等优点，被广泛应用于食品、医药、化工、纺织、建筑材料、化妆品行业和其他工业部门。其中用于食品和饮料行业的为50，医药行业为20，化学工业为20，化妆品为2，其他8。,在食品工业中，柠檬酸由于其适度的酸味可增进食品味道，并能抑制微生物生长而使食品保鲜，赋予食品和饮料纯正舒适、柔和可门的酸味，既能增强食欲，又能使肠胃内摄入的纤维素、钙等物质迅速溶解。 柠檬酸又是一种整合剂它能整合钙、镁、铁等微量元素，从而防止饮料的浑浊。柠檬酸与维生素共用又是一种良好的抗氧剂。 在医药工业中，作为抗凝血剂，可防止血液中凝血的生成。还可用于生产柠檬酸钠作输血剂，生产柠檬酸铁铵作补血药。,在化学工业中，柠檬酸三乙酯三丁酯可做无毒增塑剂，制食品包装璜塑料薄膜；柠檬酸三乙酯、三丁酯可作肥皂或香皂的添加剂，柠檬酸和铵盐可作防锈剂；柠檬酸锌可作为微量元素肥料使用；柠檬酸还可用于柠檬酸可溶件钾肥和复合肥料；另外柠檬酸还可制造防止型表面活性剂、皮革加脂剂等。 在洗涤剂工业中，柠檬酸在无磷酸盐洗衣粉、液体洗涤剂等配方中使用。可代替三聚磷酸钠，增强洗涤刑的去污能力。,在建筑工业中，可做混凝土缓凝剂，提高工程抗拉、抗压、抗冻性能，防治龟裂。 在化妆品业中，可做抗氧剂和发泡剂。 在油田工业方面，柠檬酸铝是一种新型油田化学品，用作水溶性聚合物的交联剂。国外在压裂、堵水、剖面调整等采油工艺中已广泛使用，提高了采油率。,3市场现状 目前，世界柠檬酸的产量，仍以美国为最。 柠檬酸属微利产品。,柠檬酸发酵历史,柠檬酸是由瑞典化学家scheere于1784年从柠檬酸果汁中提取制成，并获得结晶。 1891年德国微生物学家Wehmer发现青霉菌能生产柠檬酸，其中以黑曲霉产酸最高。 1923年美国弗滋公司研制成功以废糖蜜为原料浅盘法发酵生产柠檬酸，并建立了世界上第一个柠檬酸工厂，从此柠檬酸进入了工业生产新时期。 1952年美国迈尔斯公司首先采用深层发酵法大规模生产柠檬酸，此后深层发酵生产工艺得到迅速发展。 近年来美国迈尔斯公司采用玉米淀粉为原料，经双曲法水解淀粉为液体葡萄糖进行浓酸深层发酵，发酵液中产酸浓度达22一23。 国外生产装置多已实现大规模自动化生产，自动化水平很高。,我国柠檬酸发酵的研究工作早在20世纪50年代就开始，60年代开始进入被粉质原料和废糖蜜原料浅盘发酵中间试验。 70年代，国内纷纷开展了淀粉原料和废糖蜜原料深层发酵高产菌株的选育，产酸能力不断提高。发展到目前，我国大多以薯干为原料，发酵法有浅盘和深层两种其中以深层发酵为主，因为这种方法更有利于大规模生产。,一、柠檬酸的生物合成与调节,1黑曲霉的柠檬酸生物合成途径 已知生长在葡萄糖培养基上的黑曲霉存在着糖酵解途径(EMP)、磷酸戊糖途径(HMP)、三羧酸(TCA)循环和乙醛酸循环的酶系。经过多年研究，现在普遍认为，黑曲霉利用糖类产生柠檬酸的生物合成途径是：葡萄糖经EMP或HMP降解，形成丙酮酸；丙酮酸一方向氧化脱羧生成乙酰COA、另一力面经CO2固定羧化成草酰乙酸：然后草酰乙酸与乙酰COA缩合生成柠檬酸(图4-1)。,二、柠檬酸发酵,主要生产菌： 黑曲霉,柠檬酸产生菌黑曲霉在生长期和产酸期都存在着EMP和HMP代谢说明葡萄糖的降解是通过两条途径共同完成的。但是，在生长期EMP：HMP为2：1，而产酸期两者的比例为4：1，即产酸期有80的葡萄糖是通过EMP代谢的。这是因为在生长期处需要通过HMP提供合成核糖等所需的前体物质，产酸期葡萄糖主要通过EMP降解，对柠檬酸的发酵生产是非常重要的。因为1mol葡萄糖经EMP降解可得到2mol丙酮酸，再经脱羧和CO2固定后，可使1mol葡萄糖合成1mol柠檬酸，这样就能获得较高的糖酸转化率 (以质量计，葡萄粉合成柠檬酸的理论转化率为l06.7，对水柠檬酸的理论转化率为116.7)：,黑曲雷中也存在TA和乙醛酸循环的酶系。但在产柠檬酸阶段，这两个循环均被阻断或减弱。因此，合成柠檬酸所需的草酰乙酸必须由含二碳的羧酸来提供。 已知丙酮酸和磷酸烯醇式丙酮酸均能经催化作用固定co而形成草酰乙酸。 经证实，在黑曲霉产柠檬酸阶段主要是通过丙酮酸羧化酶的催化作用，使丙酮酸固定co而形成草酰乙酸。 从葡萄糖合成柠檬酸的总反应式为：,黑曲霉糖质发酵柠檬酸,证明生产菌（黑曲霉）中80%的糖代谢走EMP途径,生产菌中存在TCA的酶系，故有TCA存在,草酰乙酸的来源不是由TCA供应，而是由2个CO2固定提供，故CO2固定对柠檬酸合成必不可少。,由于不存在苹果酸脱氢酶,丙酮酸羧化酶,PEP羧激酶,生物合成途径（无碳原子损失）,理论转化率：106.7%,C6H8O7 H2O理论转化率：116.7%,能量平衡,EMP中底物水平磷酸化,2ATP,EMP途径,2NADH,丙酮酸氧化脱羧,2NADH,可以满足生产菌的维持能量消耗， 不需要消耗C源经TCA来产能,2、 柠檬酸合成的代谢调控,第一个调节酶是磷酸果糖激酶（PFK）, 柠檬酸和ATP对该酶有抑制,生产菌需要解除该抑制作用,AMP、无机磷以及NH4+对该酶有活化作用,NH4+有效解除柠檬酸和ATP对该酶有抑制 ，故生产上通过添加铵盐来提高柠檬酸产量, Mn2+的影响：,Mn2+缺乏,菌体的TCA酶活下降,Mn2+缺乏,可能干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解,NH4+水平升高,减少柠檬酸对该酶的抑制,第二个调节点：CO2固定的酶活力高，保证草酰乙酸的供应,第三个调节点：TCA环上调节,柠檬酸合成酶：,许多细胞中该酶是TCA的调节酶，但在黑曲霉中此酶无调节作用,顺乌头酸水合酶：,理论上此酶失活,TCA环阻断,积累柠檬酸,顺乌头酸水合酶需要Fe2+,故在发酵液中添加黄血盐络合Fe2+阻断TCA环，积累柠檬酸,黑曲霉乌头酸水合酶存在于线粒体中，它催化的反应存在着柠檬酸：异柠檬酸：顺式乌头酸 = 90：7：3的平衡关系； 黑曲霉对辅酶NAD+专一性的异柠檬酸脱氢酶活力很低，却有三种依赖于辅酶NADP+的异柠檬酸脱氢酶，其中的两种与存在于线粒体的酶及TCA循环有关，它们受到生理浓度柠檬酸的抑制。,为什么在A. nigar中异柠檬酸不会进一步分解及柠檬酸的积累机制？,另外发现，柠檬酸产生菌黑曲霉中除存在正常(标准)呼吸链外，还存在一旁系呼吸链，该呼吸链在完成H传递(氧化)过程中不产生ATP。由于O2是柠檬酸发酵过程生成NADH2重新氧化的H受体，故通过旁系呼吸也可以减少ATP对PFK酶的抑制作用。 但是，与正常呼吸链不同缺氧对旁系呼吸链的损伤是不可逆的，因此在产酸阶段一定要保证足够的溶氧供应。,此外,柠檬酸的合成是在线粒体上，合成后则分泌于细胞外，而合成过程中有些酶则在细胞质内、因此合成过程的中间物和终产物在线粒体、细胞质和细胞外的输送、转移及其调控等问题也是十分重要的。至于柠檬酸生物合成在基因和分子水平上的调节，这里就不作讨论了。,3正烷烃为原料的柠檬酸合成与调节,（1） 以正烷烃为原料合成柠檬酸是利用酵母为生产菌种的。 （2）首先是将烷烃氧化成相应的脂肪酸，然后经-氧化作用生成乙酰CoA 。乙酰CoA(或乙酸、乙醇)经过TCA循环和乙醛酸循环生成草酰乙酸，并且再缩合成柠檬酸。 （3）由正烷烃生物合成柠檬酸不涉及CO2固定，但合成柠檬酸的草酰乙酸必须出乙醛酸循环获得。因此，柠檬酸必须转化至异柠檬酸并进行裂解。这是酵母菌利用正烷烃发酵柠檬酸时终产物除柠檬酸外，一定存在异柠檬酸的原因。 （4）在酵母的烷烃发酵中，柠檬酸的积累是在培养基氮源耗尽后开始的，由于这时细胞内AMP急剧下降，抑制了NAD异柠檬酸脱氢酶，使柠檬酸的合成大于分解，从而大量积累柠檬酸： 至于为什么也积累大量异柠檬酸(有时占总政的50)，可能是与反应中几种酶在细胞内存在的部位不同有关；,二、柠檬酸发酵的生产菌种,1柠檬酸的产生菌 国内外研究者都检测到大部分黑曲霉都能产生柠檬酸。此外，泡盛曲霉、温特曲霉、字佐美曲霉、海枣曲霉、炭黑曲霉、棒曲霉和斋藤曲霉，也能大虽分泌柠檬酸。但是目前用于工业化的生产菌种几乎都是黑曲霉。,但是，以石油、乙酸、乙醇等为原料时，似乎都是酵母才能作为柠檬酸的生产菌株：如解脂假丝酵母、热带假丝酵母、季也蒙假丝酵母等假丝酵母，以及毕赤酵母、汉逊酵母和红酵母属菌种也都能发酵正烷烃产生柠檬酸。 但是酵母利用石油原料生产柠檬酸时几乎无一例外地伴随着产生相当数量的异柠檬酸。 除霉菌和酵母外，不少细菌，如节杆菌、诺卡苗、放线菌、毛霉、木霉等也能产生少量柠檬酸。,2、高产柠檬酸菌株的特征,一般高产：柠檬酸的菌株都具有一定的生理或形态特征。对于黑曲霉其主要特征有： 在葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长不太好，形成的菌落较小，形成孢子的能力也较弱； 能耐受高浓度的葡萄糖并产生大量酸性-淀粉酶和糖化酶，即使在低pH下两种酶仍具有大部分活力；,能耐高浓度柠檬酸，但不能利用和分解柠檬酸； 能抗微量金属离子，特别是抗Mn2+、 Zn2+ 、 Cu2+和Fe2+等金属离子； 在摇瓶和深层液体培养时能产生大量细小的菌丝球； 具有旁系呼吸链活性，利用葡萄糖时不产生或少产生ATP,三、柠檬酸的发酵生产,目前柠檬酸的生产都是采用微生物发酵法。由于所用的菌种、原料和其他生产条件的不同，生产方法也不一样。工业生产方法主要有深层液体发酵法、浅盘液体法以及固体原料的浅层制曲或厚层通风制曲法。 此外，日本和我国台湾省等地曾采用过以蔗渣等农副产界为载体加液体营养源进行的沉寂半固体发酵，但是近年来随着工业生产规模的扩大，后两种方法已基本被淘汰。,(一)柠檬酸发酵的原料与培养基,1原料 理论上凡是能够被微生物代谢并分泌积累大量柠檬酸的物质都可作为柠檬酸的发酵原料。目前实际用于柠檬酸发酵生产的原料可分为糖质原料和石油烷烃原料两大类。 糖质原料包括甘薯、薯干、木薯、木薯干、马铃薯、薯渣等薯类，玉米、小麦、面粉、大米等谷物类，各种淀粉、淀粉水解糖(单糖、双糖、糊精、治榜、葡萄糖母液)砂糖、糖接以及各种含糖果实、糖食加工的下脚料等。 石油烷烃原料包括正烷烃、乙酸、乙醇等：,2原料的预处理 含淀粉或糖质的原料，发酵前往往需要进行预处理，如去杂质、去霉块、粉碎、液化以及去金属离子等。,(1)淀粉原料的液化 虽然柠檬酸生产菌黑曲霉能产生和分泌淀粉酶和糖化酶，但是为了缩短发酵时间，对于各种淀粉以及薯干、木薯、玉米粉粉碎后的原料郁需预先进行液化，就是说需要利用化学或生物催化剂使淀粉大分子断裂使淀粉糊成为粘度明显下降、流动性较好的液体。 目前柠檬酸发酵生产均采用酶法进行液化。最简单的办法是投料后将-淀粉酶直接加入料液中，在一定温度下(80I05，视酶的耐热程度而定)作用一定时间。出于淀粉酶能随机切断淀粉分子内的-1，4-糖苷键，使淀粉分子断裂淀粉糊联度迅速下降。液化作用除与淀粉浆浓度有关外，还与淀粉酶的性质、加酶量、作用温度、作用时间、介质pH以及钙的存在与否有关。通常液化终点是控制在料液与碘反应不且蓝色为止，对于以淀粉为原料的柠檬酸生产菌种，液化液的DE值在20左右即可。,(2)糖蜜原料的预处理 国外柠檬酸生产主要以糖蜜为原料。糖蜜是甘蔗或甜菜制糖后的剩余物，除含有丰富的糖分外，还含有大量的金属离子以及硫胺素、核黄素等生长因于。虽然糖蜜的组分随品种、产地及制糖工艺而异，但是糖蜜中的金属离子都将明显影响黑曲霉产生柠檬酸，如果直接用糖蜜培养黑曲霉，将难以获得满意的产酸效果。因此在发酵前糖蜜需要进行预处理： 糖密预处理的方法很多，最常用的方法是添加黄血盐亚铁氰化钾，k4(CN)6Fe3或者经硫酸、磷酸处理，也可添加活性炭、EDTA、单宁、石灰以及通过离子交换树脂等，还可采用几种方法交替处理。,3柠檬酸发酵培养基的营养要求 柠檬酸发酵培养基主要有两方面的作用：一是在发酵初始阶段提供黑曲雷生长繁殖的营养需要和维持生命活动的能量；二是作为生物合成柠檬酸的基质。前者除要提供碳(能)源物质外，还需一定的氮源和其他生长因子，出于过量含氮物质不利于柠檬酸的产生，因此柠檬酸发酵培养基的主要成分是碳水化合物。 目前国内所用的柠檬酸发酵培养基主要原料足各种含淀粉的农副产品，它们既含丰富(主要成分)的碳水化合物，也舍有一定的蛋白质之类的氮源和微量元素等物质，因此以农副产品为原料时就不必添加无机盐。,(二)柠檬酸发酵的生产工艺,1深层发酵法 深层通气发酵是柠檬酸发酵生产的主要方法。国内以淀粉质粗原料为培养基，发酵产酸一般为11一13，最高达15，糖酸(一水柠檬酸)转化率90104，发酵周期为50一70h。国外以淀粉水解酶为原料，产酸达19，发酵周期5d以上。,(1)深层发酵法的生产工艺流程,(3)发酵工艺 柠檬酸发酵过程包括斜面培养、麸曲制备、种子罐培养和发酵几个阶段。 斜面种子培养：斜向培养基为10-12。Bx的麦芽计或米曲汁，也可采用20马铃薯煮出汁琼脂培养基，3335培养45d，至斜面长满孢子即可。,麸曲制备。用1000ml角烧瓶装款皮40g左右，麸皮选用较粗者为好，必要时应先用水洗涤除去淀粉。麸曲的含水量要合适，一般控制在60一65左右，麸曲种子的培养温度约34培养1天后要“敲瓶”一次，使之上下翻动。培养好的麸曲应仔细观察合无其他霉菌污染并抽样作摇瓶产酸测定，合格者贮存于小于20的条件下保藏。,种子罐培养。种子罐体积一般为发酵罐的110，薯干粉浓度为16一20，比发酵罐浓度稀些，但需要添加定量含氮物质，如0.3(NH4)2SO4观或尿素或适量的麸皮等. 种子罐培养温度为34,培养时间1624h，至略微产酸即转入发酵罐中。,影响柠檬酸发酵的几个问题,a 通气与搅拌(溶氧)对柠檬酸发酵的影响 黑曲霉是需氧菌它的生长、繁殖和维持生命活动以及由葡萄糠转化为柠檬酸时都需要耗用一定的氧气。在一定范围内培养基的溶氧分压几乎与产酸成正比，溶氧分压低，产酸明显受影响或甚至完全不产酸。特别是考虑到，在发酵1530h这一阶段，菌体大量生长繁殖耗氧量最大，而产酸阶段耗氧虽略有减弱，而在这一时期缺氧造成的损伤是不可逆的。因此在整个发酵过程中一刻也不能停止通气和搅拌，才能保证溶氧的供应。,加大通气或搅拌均可提高溶氧分压，但通气和搅拌均需耗用大量电能，而且强烈搅拌的剪切力有可能损伤黑曲霉菌丝，过度的通气不仅易产生泡沫，而且有可能导致降低CO2浓度，影响CO2固定。因此必须根据发酵设备、培养基以及菌种特性的情况，合理控制通气和搅拌，既保证所需溶氧的供应，又经济节能。,b 关于柠檬酸发酵菌丝球问题。 黑曲霉发酵生产：柠檬酸时，菌丝球的形成与产酸密切相关。 所谓菌丝球是指由许多真菌菌丝缠绕而成的小球，它是由菌球中心向四周辐射的分支菌丝构成的。 菌丝球的大小、结构和数量对产酸有明显影响。发酵过程若产生分支状菌丝、不成小球，则一般产酸很差；若菌丝球大而结实，产酸也不好：若菌丝球伸“脚”茵丝太多，产酸也受影响；只有形成小而紧密、核心部分呈空心状的菌丝球产酸才良好。,因为这种菌丝球增大了菌丝与培养基接触界面，利于对营养物质和溶氧的吸收，同时形成菌丝球改善培养基的流体性质，利于氧的传递； 据认为在薯干原料的柠檬酸发酵中，菌丝球的含量在1000个ml以上，菌丝球直径在o1mm左右，菌丝球表面毛糙的发酵产酸必然良好； 菌丝球的产生与否以及其结构、数量除了与生产菌株特性有关外，也与接种量、培养基组分、发酵罐结构等有关。 接种量大(孢子数多)形成的菌丝球多而小，反之则菌丝球大而少；培养基粘稠度大有利于形成较紧密的菌丝球。,c 微量元素与柠檬酸发酵。 已知Mg2+ 、Zn2+、 Mn2+、 Cu2+、 Fe2+和S、P、K、Na等元素都是黑曲霉生长所必需的。但是它们对黑曲霉的柠檬酸生物合成并非同等重要。 Fe2+ 、 Zn2+和Mn2+三种元素对柠檬酸发酵的影响更为显著Fe2+是生物体内多种酶的组成部分，特别是氧化还原过程必须有铁的存在， Fe2+又是TCA循环中顺乌头酸酶等的激活剂，因此传统亡认为铁的缺乏是柠橡酸积累的必要条件之一。但事实并非如此简单，只有在磷、锌、锰等充裕时才呈现这种作用。,另外， Cu2+对Fe2+有拮抗作用。 Cu2+也是黑曲霉生长所必需的，它是多种酶的组分，(Cu2+不仅能拮抗Fe2+的作用，对Mn2+的负效应也有抵消作用，但高浓度Cu2+对柠檬酸产生也有毒害作用。,Mn2+参与黑曲霉的多种代谢， Mn2+既是异柠檬酸脱氢酶和草酰乙酸酶的组成都分，又是TCA循环中多种酶的激活剂，还参与蛋白、核酸的合成， Mn2+浓度高时，柠檬酸合成明显受影响，其作用远甚于Fe2+ 。如前所述， Mn2+的不足可使细胞内NH4+浓度升高从而解除柠檬酸对酵解途径的抑制作用。,2 柠檬酸生产的团体发酵工艺 利用农副产品加工后的副产物如甘薯、木薯的薯油、苹果渣等，添加麸皮、米糠等含蛋白辅料和无机盐，就可进行固体发酵生产柠檬酸。此法虽投资少且可利用农产品下脚料，但劳动强度大、劳动生产率低，不适于大规模工业化生产。固体发酵工艺流程如下：,麸曲种子以麸皮为主料，添加o5CaSO4和o25(NH4)2S04以及等量的水灭菌后接种培养。主料的含水量以70为宜，若不够需先补水，然后接麸曲种子并拌匀。可用搪瓷盘或木盘装曲。曲层厚度一般为5cm左右，曲室温度35，相对湿度控制在85一90，培养2040h品温可能上升至40，此时应降低室温。以后维持在35左右。由于曲架上下层温差较大，故发酵40h后应将曲盘上下调换。发酵周期4d，产酸率(曲中柠檬酸对原料总糖的百分比)约70。 固体发酵应注意曲房的消毒工作，耍经常用甲醛或硫黄熏蒸，细菌污染严重时可添加抗生素进行防治。麸曲培养结束后加热水浸泡，然后过滤并用钙盐法提取柠檬酸。,3液体表面发酵法生产柠檬酸工艺 表面发酵法也称浅盘发酵法，它是柠檬酸生产的一种传统方法，国外已有悠久历史，丛至今有些国家仍然采用。表面发酵法的优点是设备投资较少、动力消耗较低，所用原料价格低廉、粗放，生产也易控制。 该法是将培养液盛于浅盘中接入孢子进行发酵，浅盘大小为：长24m、宽12m、高0.15-0.25m每盘可装培养液0.5-1cm.盘子用不锈钠或高纯度铅或木料(涂料处理)制成，培养室装有盘架，每个盘架的一端装有通风管和鸭嘴形的通风口烘接种干抱于和通风之用。发酵室内装有通风、温度、湿度调节装置，整个发酵室是密闭的，利于进行清洗消毒操作。,发酵培养液以糖蜜为原料，灭菌前用黄血盐处理，培养基的糖浓度约4左右，需加入适量硝酸铵、氯化钙及其他无机盐。培养基灭菌后通过管道注入盘内，液层高约10 。并直接接入于盘子，同时通入热的无菌空气使发酵维持在30。培养2d转入产柠檬酸期并且产生热量，此时要通入空气使温度继续维持在3。,最简单的工艺为一次发酵法，即接种后发酵12d至发酵终了，然后放料取出菌丝体，清洗盘子再重新装入灭菌培养基。 此外，也可采用置换法，即一次发酵终了后，将酸液从菌膜底下排山，再从膜的下方通入无菌水将膜中残存的柠檬酸浸出并排放，然后通入新鲜培养基继续发酵。 也可采用添加法，即先注人生长期培养基，液层高约3，待菌膜形成后排出生长液，然后通入产酸培养基，液体厚1012cm，直到发酵终了。表面发酵法的柠檬酸产酸可达8一9但对糖的转化率较低，一般仅506。,4石油发酵生产柠檬酸工艺 20世纪70年代国内外曾开展过以正烷烃为原料的石油发酵柠檬酸的研究热潮。以 正烷烃为主要原料，生产菌种为解脂假丝酵母、热带假丝酵母等，采用深层发酵法，培养基除正烷烃(浓度6一9)外，还要添加酵母膏、铵盐、磷酸盐和碳酸钙，湿度2830发酵4d，产酸可达10一12。总酸对石油的转化率在100一140(对一水柠檬酸 转化率为250)：烷烃转化为柠檬酸时耗去更多的氧，出此要求发酵设备具备更好的传质效果以提供更多的溶氧。 与黑曲霉发酵生产柠檬酸不同，酵母发酵生产柠檬酸时需要培养基的pH维持友56，团此发酵产酸后要添加中和剂ao也可流加NaoH中和,假丝酵母发酵石油生产柠檬酸最大问题是在产生柠檬酸的同时伴随着相当的(几乎是等量)异柠檬酸，由于两种柠檬酸在化学性质上存在较大差异，使产物提取产生很大困难： 经通过诱变育种获得对单氟乙酸敏感的菌株，使柠檬酸与异柠檬酸的比例由原来的50：50变为60：40，或甚至97：3。 由于柠檬酸主要用于食品工业，石油发酵生产的柠檬酸其安全问题一直为人们所关注和争论后来世界出现石油危机，因此20 世纪7年代后期石油发酵柠檬酸的工作也告小止。,5柠檬酸发酵生产的其他工艺方法 多年来曾经不断地进行过各种柠檬酸发酵新方法的探索，发表过不少文章和专利，如柠檬酸的连续发酵法、固定化黑曲霉孢子发酵生产柠檬酸等，但是至今尚未获得适合工业化生产的工艺方法。 固定化细胞生产柠檬酸一般是利用产柠檬酸的黑曲霉菌株，在斜面或麸曲上培养使之产孢子，然后收集孢子制成孢子悬液，再经海藻酸钠制成固定化细胞。,发酵生产柠酸前先将固定化孢子浸泡在低浓度糖液中颈培养1d左右至把子曲发，然后转入发酵培养中进行发酵产酸。 从已报道的结果看，固定化细胞的发酵产酸不如游离细胞，残糖也较高。虽然固定化细胞可重复使用多次，但是至今未能推广应用。,四、柠檬酸的提取工艺,发酵液中除含柠檬酸外，还含有黑曲霉菌丝体及自溶物、原料残渣(主要是纤维素)、未利用的还原糖、非发酵性糖以及发酵过程产生的色素及其他有机酸等。 要制备结晶柠檬酸必须设法除去这些杂质，因此用发酵法生产柠檬酸都需经过反复分离纯化才能得到结晶成品，这些过程包括：过滤除去发酵液中菌丝体，原料残渣及其他各种固形物质；用化学或物理或两者结合的方法除去柠檬酸以外的基他杂质初步纯化柠檬酸；精制得到结晶柠檬酸。,提取柠檬酸的方法主要有钙盐法、离子交换法、萃取法、电渗析法以及近年来发展起来的色谱分离法；但目前普遍使用的仍然是钙盐加离子交换的提取方法。,1发酵液预处理 预处理是指待发酵液加热至7590，可以及时杀死柠檬酸产生菌及其他杂菌，终止 发酵作用，同时使发酵液中部分蛋白质变性、絮凝、降低酵液浓度利于过滤。此外也可能使菌体内部分柠檬酸释放出来。预处理加热时间不能太长，若破坏菌丝球则影响过滤。,2过滤 过滤的目的是除去发酵液小各种悬浮的固形物质。我国采用薯干粗原料发酵生产柠檬酸，发酵液中除含菌丝外，还含有大量的原料残渣，团形物杂质较多，因此不宜采用各种离心或固液分离设备，而应采用能容纳较多滤渣的过滤设备；目前最常用的是各种板框压滤价和真空带式过滤机，对正常发酵的酵液，只要过滤介质(滤布)选择合适，可不必添加助滤剂就能顺利地进行过滤。,板框过滤时开始阶段不必加压，待滤饼形成、滤速减慢时可适当加压.为了提高过滤收率，完成过滤后用热水再进行一次复滤，或者从过滤机中取出滤渣加水打成浆后再滤一次。,3中和 Ca2+ 在一定温度和pH条件下可与柠檬酸作用生成柠檬酸钙。出于形成的Ca3(C6H5O7)24H2O在水中的溶解度极小，因而能形成沉淀面与其他杂质，如糖、可溶性蛋白等分离。 生石灰(CaO)、熟石灰Ca(OH)2 、氯化钙(CaCl2)以及碳酸钙等均可作为中和剂，但最常用的是碳酸钙。中和剂的用量可依据反应式和中和剂的纯度计算得出。例如用碳酸钙中和时的反应方程式为：,因此中和I00kg的一水柠檬酸需要100的碳酸钙71.43kg。,中和终点的控制可用测量PH法或漓定酸度的方法来确定。中和终点一般控制在酸度o1一o2，若测量pH则以4448为宜(以碳酸钙为中和剂)；中和终点的pH对柠檬酸钙的质量有决定性影响，偏酸范围时柠檬酸钙质量好，但酸件下溶解度大损失也大。中和沉淀后经固液分离(一般H抽滤或带式真空过滤机)虽可除去大部分对溶性杂质，但仍有相当部分糖类物质吸附在沉淀表面，所以中和过滤后需要洗占钱粮，即用80一90的热水对沉淀进行洗涤，洗涤终点以检查洗涤滤液是否