培养基质量保证与质量控制.ppt

培养基质量保证与质量控制,培养基制备指南(SN/T1538)简介 李卫华 山西出入境检验检疫局技术中心,微生物检测的定义,在特定的环境下（无菌），采用适当的方法对样品中目标微生物进行增殖和培养，并对经放大后的目标微生物进行感官、生理、生化等方面的特性分析和判定，以确定样品中目标微生物的量和/或质的特性的过程。,微生物检测涉及的要素,检测人员 检测经验和判断能力 检测设备 保证目标菌种的生长的外部环境 菌种试剂 保证目标菌种生长的内部环境 检测方法 选择适宜目标菌种检测的方法 测试环境 保证操作过程不受外界干扰（保护样品和人员）,培养基的质量保证与质量控制,质量保证 quality assurance 为使人们能确信某个产品(这里只培养基)能满足规定的质量要求所必须执行的有计划的和系统的活动 提出质量要求并制定系统的质量控制计划 质量控制 quality control 为达到质量要求所采取的操作技术和活动 为达到质量要求所采取的具体的技术操作,培养基制备指南：SN/T1538,SN/T1538.1-2005(2005年7月1日实施) 第1部分:实验室培养基制备质量保证通则 提出要求并制定系统的控制计划 属于质量保证的范围 SN/T1538.2-2007(待发布) 第2部分:培养基性能测试实用指南 为保证提出的质量要求所需要采取的技术操作 属于质量控制的内容,标准制定情况简介,SN/T1538.1修改采用了ISO/TS11133-1：2000（E）(2000年6月1日发布) SN/T1538.1修改采用了ISO/TS11133-2：2003（E）(2003年12月25日发布),本标准的作用,SN/T1538为培养基质量保证和质量控制标准体系，有利于对培养基的标准化管理，提高实验室检测质量： 第1部分为质量保证和培养基质量基本要求 第2部分为质量控制技术 为CNAS合格评定的微生物实验室认证工作提供参考依据,重点讲解内容,相关术语 主要质量保证要求 质量控制方法 质控菌株,培养基,液体、半固体或固体形式的，含天然或合成成分，用于保证微生物繁殖或保持其活力的物质,培养基类型,各别成分培养基 Culture medium prepared from individual components 实验室用不同的化学和/或生物试剂按照一定的配方、比例配置而成的培养基 即用型培养基 ready-to-use medium 以即用形式置于容器中( 例如：平皿、试管或其它容器) 供应的培养基。 脱水合成培养基 culture medium prepared from commercially dehydrated formulation. 不立即使用的干粉形式的(如：粉末、小颗粒、冻干等形式)培养基。,标准的主要内容,购置验收要求(CNAS-CL01 ：4.6.2) 生产企业提供资料 实验室外观检查记录 储存、使用、弃置要求（CL11：5.9) 成品的质量控制(概述第2部分.重点为菌株) 物理指标:培养基外观 微生物指标:重点提到对测试菌株的要求 SN/T1538.1,常规质量控制要求 物理指标:外观控制 微生物指标:污染;生长率;选择性;特异性(CNAS-CL01 : 4.6.2; CNAS/CL11：5.9) 性能测试方法举例 对质量控制要求的补充说明和详细实例 SN/T1538.2,购置验收要求,生产企业提供材料： 产品标签： 产品名称、编号 批号 使用前的pH 必要的安全/危害数据 有效期 技术数据清单 质控证书 性能评价 所用测试菌株,实验室验收： 产品标签： 名称和批号 有效期 接收日期 包装及其完整性 SN/T1538.1-2005中4.1;对应CNAS/CL01 4.6.2内容,通常要记录(采购服务和供给),储存要求,例行常规检查内容: 容器密闭性复查 首次开封日期 内容物的感官检查 使用前检查(即用型培养基): 颜色是否发生变化? 是否蒸发/脱水? 是否有微生物生长 ? 注:SN/T1538.1:2005中4.2;对应CNAS/CL01:4.6.2内容,可不做记录,实验室自制和使用要求,培养基用水 称量和复水 溶解和分装 pH测定 灭菌 监测,琼脂培养基融化 培养基脱气 添加成分制备和加入 平板的制备和储存 培养 注:SN/T1538.1-2005中4.3-4.4内容,对应CNAS/CL11:5.9部分内容,红色部分通常需做记录,培养基的弃置要求,所有污染和未使用的培养基的弃置必需采用安全的方式，并且要符合相关法律法规的规定。 注:SN/T1538.1-2005中4.5内容,应符合CNAS/CL01:5.3.5(废弃物处理程序)要求,质量控制基本要求,对培养基的要求 分装数量 外观、色泽和均一性 琼脂凝胶的硬度 水份含量 pH 缓冲能力 微生物污染(即用培养基),对基础成分的要求 对不稳定的生物成分，使用时可根据情况调整用量。,注:SN/T1538.2中对制造商的要求,微生物学要求,微生物污染 生长特性 生长率 选择性 生理生化特性 选择性和特异性 抗菌实验特性 红色部分为对培养基进行质量控制的主要内容,生长率(定量测试方法),PR = NS/NO NS ：待测培养基平板上得到的菌落总数。 N0 ：参考培养基平板上获得的菌落总数，应100cfu 要求：非选择性培养基上目标菌的生长率最低应为0.7，该类培养基应易于目标菌生长；选择性培养基上目标菌的生长率最低应为0.1,选择性(定量测试方法),SF = DO DS D0：能在参考培养基上生长至少10个菌落的最高稀释度 DS：能在测试培养基上显示生长的最高稀释度 非目标菌在选择性培养基上的SF至少为2 半定量和定量法中，非目标菌应部分或全部被抑制,培养基测试方法,定量测试方法 半定量测试方法 定性测试方法,几种方法的使用原则,通常使用半定量或定性测试方法就能满足实验室对培养基性能测试的要求 评价新的培养基或新的供应商的产品时，应采用定量测试方法 采用定量方法时，必须使用参考培养基进行对照；采用半定量和定性方法时，使用参考有助于结果解释。 参考培养基必须是从近期批次中选出的已知质量良好的培养基。,介绍几种常用的质控方法,Miles-Misra法(定量方法) 改进的平板划线法(半定量方法) 平板接种观察法(定性方法) 上述均为固体培养基测试方法,液体培养基定量和半定量测试方法也要通过固体培养基菌落计数技术才能得到结果。,改良Miles-Misra法,操作方法,测试菌株过夜培养物10倍稀释 测试平板和参照平板划分为4个区域并标记 从最高稀释度开始 ，分别滴一滴稀释液于试验平板和对照平板标记好的区域 将稀释液涂满整个1/4区域，37C培养18 hr。 对易计数的区域计数，按公式计算结果,方法举例,测试培养基在10-5稀释度上有30个菌落 参照培养基在10-5稀释度上有40个菌落 通过公式计算： PR = 10-5 30/ 10-5 40=0.75 注：在几种固体计数方法中，Miles-misra方法和螺旋平板涂布法效果较好。,改进的划线法接种法模式图,计 算,计算生长指数G ： 每条有菌落生长的划线记作1分，每个 仅一半的线有菌落生长记作0.5分 没有菌落生长或生长量少于划线的一半，则记作0 如：菌落在A区和B区全部生长，而在C区有一半线生长则G 为10,目标菌在培养基上应呈现典型的生长，而非目标菌的生长应部分或完全被抑制 目标菌的生长指标G大于6时，培养基可接受,结果解释,定性测试方法,用3mm接种环取测试菌培养物，在测试培养基表面划平行直线。可同时在一个平板上接种多个菌株，但划线不能交叉 按标准中规定的培养时间和温度对接种后的平板进行培养,结果解释,培养后按以下方法计分： 0表示无生长 1表示微弱生长 2表示生长良好 目标菌得分应为2，并有典型的菌落外观、大小和形态 非目标菌的生长应部分或全部被抑制,质控菌株要求,标准菌株：来自国际/国家菌种保藏中心(本标准要求为ATCC菌株)或经ISO9002认证的经销商提供的菌株(有资质) 制备储备菌株和工作菌株时一次制备多份，每株菌原则上不能重复使用 通常工作菌株不能再传代，但处理得当可再次使用,标准储备菌株(Reference stock),标准菌株在实验室经过一次传代获得的一组完全相同的菌株 传代菌株应当完全具备标准菌株的所有性状 传代时要保证一定的量(减少传代次数) 每株菌株尽量避免多次使用 采用不同的保存方法保存期限不同 如冻干法,液氮法,穿刺法,液体石蜡法,斜面保存法等(见后),菌种保藏方法,液氮保存法 低温保存法 液体石蜡保存法,液氮保存法,保存 制备细胞悬液，甘油或二甲亚砜作保护剂 分装无菌安瓿瓶，每管0.2ml 预冻至-40（控制温度下降速率为1min） 放入液氮生物贮存罐中气相保存 恢复 直接浸入38水浴中解冻510min 转接于适宜培养基内培养 注意：大多数属种适于慢速冻结和快速解冻,适用菌种,病毒 支原体 各类细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌 蓝藻 动物细胞,液体石蜡覆盖保存法,传代保存的变相方法 能够适当地延长保存时间 优质石蜡121高压灭菌2小时，160干燥箱中灭菌12小时，放冷备用 液体石蜡的深度以1cm左右 保存期通常6个月至一年,适用菌种,霉菌、酵母菌、放线菌、部分细菌。如：大肠杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌等需氧性细菌 不能用于低温冷冻保存的微生物（如孢子形成能力极差的丝状菌） 不适于用菌种：固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、沙门氏菌，丝状菌中的毛霉、根霉菌等,甘油低温保藏法,保藏方法：菌种悬浮在10(体积分数)甘油蒸馏水中。置于低温(-70)保藏。 注意事项：所要保藏的菌种，最好先培养至对数期；使用液体培养基时，可直