拟南芥叶片总RNA提取.ppt

拟南芥叶片总RNA提取,2019/8/1,拟南芥,拟南芥是一种细长而直立的植物，羽状多叶，茎高度达40厘米。二年生草本，基生叶有柄呈莲座状，叶片倒卵形或匙形；茎生叶无柄，披针形或线形。总状花序顶生，花瓣4片，直径约3毫米，白色，匙形，雄蕊6枚，花药黄色，雌蕊圆柱状，花柱短，柱头凹陷；果实豆荚形，长11.5厘米，薄，轻微向上弯曲，成熟时开裂；果瓣有1中脉及侧脉；种子12行，呈卵形，长约1毫米，成熟时红褐色；子叶背倚胚根。花期35月。,2019/8/1,拟南芥是在植物科学，包括遗传学和植物发育研究中的模式生物之一。其在农业科学中所扮演的角色正彷佛小鼠和果蝇在人类生物学中的一样。尽管拟南芥在农业上并无多少直接的贡献，但其优点使其成为研究有花植物的遗传、细胞、分子生物学的典型。拟南芥基因组之小有利于基因定位和测序。其基因组大约为12,500万碱基对和5个染色体，在植物中算是小的。在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。在探明至今已发现的25,500个基因的功能上已作出了非常多的工作。 植株之小于生活周期之短同样也是拟南芥的优点。实验室常用的许多品系，从萌芽到种子成熟，大约为六个星期。植株之小方便其在有限的空间里培养，而单个植株能产生几千个种子。此外，其自花传粉的机制也有助于遗传实验。 所有这些都使拟南芥成为遗传研究的模式生物。,2019/8/1,RT-PCR,RT-PCR是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。,2019/8/1,RNA提取的常见问题,RNA降解 OD260/OD280比值偏低 RNA含有DNA污染 RNA提取量偏低 提取的RNA不溶 下游实验效果不佳,2019/8/1,RNA降解,使用的组织材料不够新鲜。提取RNA的组织材料应采用新鲜的组织材料，或将新鲜的组织材料用液氮迅速冷冻后置于-80保存。 提取RNA时使用的试剂及器材中混有RNA分解酶。 提取的组织材料中含有大量的RNA分解酶，而RNAiso Plus的添加量不够,2019/8/1,OD260/OD280比值偏低,样品裂解时加入的RNAiso Plus量偏少，造成蛋白变性不充分，可以再次对RNA溶液进行苯酚/氯仿抽提，以除去蛋白。 含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在室温静置，或静置的时间不足5分钟。 相分离后，吸取上清液时不小心接触蛋白层造成污染。 RNA未充分溶解。,2019/8/1,RNA中含有DNA污染,裂解组织或细胞使用的RNAiso Plus量偏少。 使用的组织材料中含有大量的有机溶剂（如：乙醇、异丙醇等）、高浓度的Buffer、碱性溶剂等。 如果提取的RNA中含有DNA时，可以使用DNase I进行DNA消化。,2019/8/1,RNA提取量偏低,向组织材料中加入RNAiso Plus后，充分研磨匀浆使其充分裂解。 相分离后请尽量完全回收上清液。,2019/8/1,提取的RNA不溶,75%乙醇清洗沉淀后不要干燥时间过长或加热干燥。 RNA沉淀中含有不溶的蛋白质混合物时，应注意在相分离后吸取上清液时，避免枪头接触蛋白层。,