课件：猪群常见疾病实验室诊断技术.ppt

欢迎参加国家生猪现代产业技术体系 “猪群常见疾病实验室诊断技术培训班”的全体学员,国家生猪现代产业技术体系,猪群常见疾病实验室诊断技术培训班,疾病控制功能室岗位专家 张桂红 教授 华南农业大学兽医学院主办,张桂红 博士、教授、博士生导师 华南农业大学兽医学院 手机办公电话Email：,联系方式,注意事项,上课时间：2009年11月13日全天报到，14日22日实验技能培训。 上午8：30上课，下午2：30上课 实验培训地点：华南农业大学兽医学院传染病实验室（即23号楼一楼） 安全问题： 吃饭：各饭堂、宾馆、东园等,猪病越来越多、越来越复杂 诊断 病理剖检变化、流行病学资料、实验室诊断、生产记录等判定疑似疾病,细菌的染色 形态学观察 培养基的制备 细菌分离培养 移植 细菌的生化试验 药物敏感试验,病猪的现场剖检,病猪病料的采集、保存,总RNA的提取 反转录 聚合酶链式反应（PCR）,猪瘟病毒抗体 猪伪狂犬病病毒gPI抗体(野毒) 猪流感血凝抑制试验 猪细小病毒病乳胶凝集试验（LAT） 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体,DNA提取 PCR,血清学检测,分子诊断,细菌分离,结果分析,日程安排,聘请原广州力智农业公司 现为德国勃林格公司高级区域技术部 方树河 总经理,第一部分 猪的现场剖检,采样注意事项,个人防护 典型病变：具有代表性、针对性 尽量无菌 适时采样 合理采样 适量采样,猪的常规检查,检查外观部位：眼、口、鼻、皮肤、肛门 检查器官：淋巴结、心脏、肺、肝、脾、胃、小肠、大肠、肾、膀胱、浆膜及浆膜腔、睾丸、肌肉、脑等,繁殖记录 采食和饮水 温度 ,各器官病理变化及可能发生的疾病,照集体照片,第二部分 病料的采集、运输与保存,血清：2-5mL，不能溶血 各组织脏器：新鲜、尽量无菌 疑似病毒性疾病，-20以下保存 疑似细菌性疾病，尽快分离，-4保存,采样的时机是否适宜 样品是否具有代表性 样品处理、保存、运送是否合适及时 与检验结果的准确性、可靠性关系极大。,一、标本的采集、运送和保管的一般要求,采集检验样品时，需要符合以下规定： 1适时采样 根据检疫要求及检验项目的不同，选择适当的采样时机十分重要。样品是有时间要求的，应严格按规定时间采样；有临诊症状需要作病原分离的，样品必须在病初的发热时或症状典型时采样，病死的动物，应立即采样。,2合理采样 按照检疫规定要求，须严格按照规定采集各种足够数量的样品外，不同疫病的需检样品各异，应按可能的疫病侧重采样。对未能确定为何种疫病的，应全面采样。 3典型采样 选取未经药物治疗、症状最典型或病变最明显的样品，如有并发症，还应兼顾采样。,4. 无菌取样 采集检验样品除供病理组织学检验外，供病原学及血清学等检验的样品，必须无菌操作采样，采样用具、容器均须灭菌处理，尸体剖检需采集样品的，先采样后检查，以免人为污染样品。 5. 适量采样 采集样品,2-5mL一次性注射器采血，将采完血样的注射器活塞，微微拔出一些，使针筒内留有部分空气，然后盖好针头盖子，将注射器针头向上成30度角，斜放，等待血液完全凝固（大概10分钟到30分钟），此过程中不能移动注射器，防止溶血。使用试管和青霉素瓶时也是一样。,（1）血样采集、保存和运送,（2）鼻、咽拭子的采集： 用无菌棉拭子在咽部涂抹数次后，放入含0.5-2ml 生理盐水、Hank液的试管中，棉拭子接触手的部分应及时折断或剪断去掉，然后盖紧试管。,对黏液脓血便应挑取黏液或脓血部分； 液状粪便采集水样便或含絮状物的液状粪便25ml； 成形粪便至少取蚕豆大小粪便1块（约5g）放于灭菌容器内，最好加有保存液或增菌液； 若无法获得粪便时，可用保存液或增菌液湿润过的棉拭子插入肛门45cm深处轻轻转动一圈，取直肠表面的黏液后取出，盛入运送培养基或保存液中送检,（3）粪便标本：,用于各种病毒性疾病病原检测病料的采集和保存以下提到病料样品，如不是直接进行实验，都需要冷冻保存（-20）以下！,（4）病毒性疾病病原检测病料,保证整个过程中，病料始终处于低温状态，十分重要。 一个简单的方法是，用废弃的矿泉水瓶，灌水后，放置在冰箱中，制备冰块，在病料运输时，将足量的冰块和病料一起放置在保温箱中（用冰块包裹所有病料，如果冰块不够多，最好将冰块放置在病料的上面和下面。密封后，由专人快速运送到检测单位。,分离病毒的组织病料：可放于50甘油缓冲液中（pH8.0），在5条件下保存数周，也可用由0.5水解蛋白，2小牛血清，青、链霉素各500Uml，制霉菌素50Uml组成的溶液保存。 510蛋黄生理盐水。,（5）细菌性疾病病料的采集、运送,在选择细菌性疾病病原检测病料时，要选择有代表性的病例。 未经抗生素治疗的病猪（最近1周未经抗生素治疗）。 有条件的最好选用活体送检。,如果是用于细菌分离的病料，必须新鲜运送，并保证整个过程中，病料始终处于低温状态（但绝对不能结冰），即4 采样尽量无菌操作，保证无人为的污染,水样：水样来源主要是下水、自来水、猪槽等。 采样器具有用于手工采样的采样瓶和自动采样器。手工采样是将水样瓶用铁架固定，塞住瓶口，待瓶沉入到一定深度时拉开瓶塞，让水样进入。,水样？,用于调查中毒的样品：包括中毒猪的呕吐物、排泄物等。 胃内容物：是确定中毒的最好样本之一。 所采集的样本可用玻璃、聚乙烯或聚四氟乙烯器皿盛装，避免使用金属器皿。采集量最好达到1OOg（ml）以上。,调查中毒的样品：,二、疑似病原后的具体的采样部位,猪 瘟（CSFV）,病毒分离 荧光抗体试验（FAT） ELISA RT-PCR 中和试验 白细胞减少,扁桃体 淋巴结 肺脏 精液 血清（病毒血症时间短） 抗体及抗原,扁桃体 淋巴结 血清 精液 肺脏,蓝 耳（PRRSV）,伪狂犬,脑 扁桃体 肝、脾 口、咽腔拭子（活体）,2019/8/6,46,可编辑,圆环病毒,诊断PCVD PCR 原位PCR(ISH) 免疫组织化学(IHC),诊断PMWS和PDNS，最好定量检测，因为：PMWS感染猪与PCV2亚临床感染猪区别在于PCV2的感染量,血清学诊断存在一定的问题！,肺脏 淋巴结(各部位) 脾,圆环病毒,猪细小（PPV）,胎儿（小于16cm）或胎儿肺脏 妊娠大于70天木乃伊胎、死胎不能用于诊断 检测病毒血凝素（在没有抗体时） 病毒分离不适合 检测新生仔猪抗体,JEV,胎儿、死胎、新生仔猪、青年猪病毒分离 胎儿或新生仔猪取脑、肝、脾、肺和胎盘,PEDV和TGEV,小肠、小肠上皮（哺乳仔猪小肠切片的直接免疫荧光、免疫组化） 粪便 RT- PCR ELISA,口蹄疫,水疱液 水疱皮,猪流感,口、咽拭子 肺脏 气管分泌物,猪脑心肌炎,心脏 扁桃体,细菌性疾病,普通琼脂 血液琼脂 LB固体培养基 TSA TSB,重点是选择合适的培养基,猪副嗜血杆菌,肺 浆膜表面物质 渗出性脑脊髓液 心脏血液 心包积液 关节液,需要NAD和V因子,（1）TSA固体培养基： 准确称取胰蛋白大豆琼脂（Tryptone Soya Agar，TSA）40克，加入940ml蒸馏水，充分摇匀后加热至充分溶解，120高压蒸汽灭菌15min，加入50mL过滤除菌的牛血清、10mL过滤除菌的0.001%NAD，充分摇匀后倒平皿。 （2）TSB液体培养基： 准确称取胰蛋白大豆肉汤（Tryptone Soya Borth，TSB）30克溶于940mL蒸馏水，充分摇匀后120高压蒸汽灭菌15 min，加入50mL过滤除菌的牛血清、10mL过滤除菌的0.001%NAD即成。,胸膜肺炎放线杆菌,G 损伤的肺组织 革兰氏染色 绵阳血琼脂分离 巧克力血琼脂,特殊的生化特性： CAMP检测 尿素酶,链 球 菌,肺、关节液、脑等 血液琼脂,大肠杆菌,肠道内容物 粪便,萎缩性鼻炎,肺 鼻分泌物 血液琼脂 1葡萄糖麦康凯琼脂,肺炎支原体,非常难分离 生长时间4周 核酸检测 抗体检测,三、实验室设计,原则：要求工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘、实验室尽量分区。,（1）核酸检测区：核酸抽提、PCR扩增区域、电泳区。 超净工作台、水浴锅、普通冰箱、离心机、PCR仪、电泳仪、电泳槽、微波炉、定时钟等等。 最好分为3个房间。,（2）血清学检测区，如ELISA、乳胶凝集、HI等 酶标仪（ELISA）等,（3）细菌分离培养区 超净工作台、普通温箱、冰箱、摇床、普通天平、显微镜等等。,（4）洗刷消毒区 烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器等。,器械：,主要用于解剖动物、取材、切割组织等。 常用器械有：解剖刀、解剖剪（直头和弯头）、镊子、持针器、止血钳子等，用毕擦净、凉干，以防生锈，消毒以煮沸、高压或用70酒精浸泡为上。,1. 各种储液玻璃瓶、吸管等 2. 培养皿： 30mm、60mm、120mm 3. 塑料制品：Tip 头、离心管等 4.其它：三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器等,器皿,物理灭菌法（紫外线、湿热、干烤等） 化学灭菌法（各种化学消毒剂）,消毒方法分为二类：,（1）紫外线消毒：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒和培养器皿。紫外线灯应距地面不超过2.5 米。 （2）温热消毒： 高压蒸气消毒：121，15 磅，20 30分钟； 干热灭菌消毒：170， 2小时。,（3）化学消毒法：最常见的是70%酒精及1的新洁而灭，前者主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。后者则主要用器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。化学消毒法操作简单、方便有效。,每组负责人 （1）