动物实验的基本技术和方法.ppt

第十章 动物实验的基本技术和方法,在医学教学、科研和医疗工作中，不论是从事基础医学还是临床医学或预防医学，都需要用实验动物来进行各种实验。通过对动物实验的观察、分析，来研究需要解决的问题，动物实验方法已成为研究工作中必不可少的重要手段。,动物实验,动物实验 整体实验:LD50、活存时间、活存率 离体实验:器官灌注、组织切片、细胞培养 急性实验：急毒，12天 亚急性实验：药效，14周 慢性或长期实验：长毒、“三致”、转基因 动物, 36个月,动物实验前的准备 一、动物的购入 购入或领取实验动物时，实验人员应向供应部门索取所用动物相应等级的由国家主管部门所颁发的质量合格证书，动物的遗传背景资料、动物微生物检查资料及动物年龄和健康等方面的资料。 若是购入或领取清洁级以上实验动物，应采用带有空气过滤膜的无菌运输罐或带过滤帽的笼盒运输，并严格检查其密封状况。,动物外观健康检查主要内容： 皮毛：有无光泽、出血、干燥； 眼：有无眼屎、流泪、白内障、角膜损伤等； 耳：有无外伤、耳壳曲折、中耳炎等； 四肢：有无弯曲、脱臼、外伤、关节炎； 肛门：有无下痢、血便、脱肛等。,二、动物饲养室及饲养器具准备 饲养室面积应根据所购入动物的数量来确定。饲养动物的器具等，应在动物购入前准备好。垫料、饲料应按购入动物数量准备。各笼箱的编号及卡片、饲喂动物所用器材，如给饵器、粪便托盘、搬运车、台秤、饲料桶、电源插板等也应准备放好。动物饲养室的环境应根据所计划使用动物的微生物控制级别来进行准备，属于屏障系统的应调整好送排风系统、空气净化系统，控制好温度、湿度、风速、噪声等环境因素。动物饲养室在启用前，应对设施、笼具及用具等统一进行彻底消毒。,编号标记 目的：为了分组 要求：清晰、耐久、简便、适用,颜料标记 颜料标记适应于较大量的大、小鼠等小动物的编号。常用的颜料有 5%苦味酸溶液 (黄色) 2%硝酸银溶液 (咖啡色) 0.5%中性品红溶液 (红色) 煤焦油的酒精溶液(黑色)。 编号原则：先左后右，从上而下。,小鼠和大鼠标号示图,烙印 用号码烙印钳在兔、豚鼠的耳朵烙号，然后在烙印部位涂上溶在酒精中的黑墨或煤粉。猪等大动物也可用此法在臀部皮肤烙号标记。也有将实验分组编号烙在狗脖套的皮带颈圈上。,纹身 用刺数钳在局部皮肤(兔多在耳朵内侧，猴多在前胸皮肤)刺上号码，再用棉签蘸上墨汁酒精涂沫刺号，多用于猴、兔的编号。,号牌 将不锈钢或铝质号牌固定在狗或猴的链条或颈圈上。兔号牌则固定在耳朵上。少量动物时也可将号牌挂在笼具上，但应防止抓取操作后将动物放错笼具而混淆编号。,毛色 利用动物的毛色将其编号，用于少量的狗、马、猫、猴等大动物的编号。 剪毛 用剪刀在狗背上剪出号码，此方法简单，字迹清楚、可靠，便于观察。 打孔 用打孔器在兔耳上打孔或剪口。,动物被毛的去除 为了排除动物被毛对实验操作和观察结果的影响，实验中需要去除或剪短动物的被毛。,剪毛法 拔毛法 剃毛法 脱毛法,脱毛剂 1) 8%NaS NaS 8g+水至100ml；也可用硫化钠8克、淀粉7克、甘油4克、硼砂1克，用自来水加至100ml。 常用于兔及小鼠等小型动物的脱毛。上述配制好的溶液57ml可用于 1512cm2皮肤的脱毛。 2) 10%NaS 硫化钠10克、氧化钙15克，自来水加至100ml。常用于狗、猪等较大动物的皮肤脱毛。 3) 硫化硷 染土布用硫化硷10克，生石灰15克，加自来水至100ml溶解后即可应用。常用于实验狗的皮肤脱毛，涂上脱毛剂23分钟狗毛即可成糊状，迅速用自来水将局部脱毛皮肤冲洗干净。此方法脱毛干净，脱毛后局部皮肤不充血。,目的：防止动物挣扎，保持安静 防止意外损伤，便于操作,麻醉,全身麻醉,1%硫喷妥钠:15mg/kg，iv/ip 2%戊巴比妥:40mg/kg，iv/ip 盐酸氯胺酮:40mg/kg，sc/im 复方氯胺酮:0.01ml/kg，sc/im,局部麻醉 1%盐酸普鲁卡因，局部注射 2%盐酸可卡因，粘膜表面麻醉,急救 原因：麻醉过量、大失血、窒息 措施：人工呼吸 强心剂：0.1%肾上腺素 呼吸兴奋剂：尼可杀米 山梗菜碱 快速输血、输液,动物的抓取与固定方法 目的：限制动物的活动，持安静状态 以便正确操作和记录 要求：不损伤实验动物 不影响观察指标 实验者不被动物咬伤 保证实验顺利进行 小心细致、大胆敏捷，切忌粗暴。,小鼠的抓取,小鼠的抓取保定： 器材：小鼠饲养盒+盒盖1套。 方法步骤： 1、用右手拇指和食指捏 住小鼠尾巴中部将小鼠提 起，放在饲养盒盖上。 2、用左手拇指和食指迅速、 准确地捏住小鼠的两耳后、 颈背部的皮肤，将小鼠提起。,3、翻转左手掌，以左手掌心和中指夹 小鼠背部的皮肤，使小鼠整个呈一条 直线。 4、用左手无名指 压住小鼠背部的 皮肤，小指压住 小鼠的尾巴根部。 5、松开捏住小鼠尾 巴的右手拇指和食指。,大鼠的抓取和固定,戴上防护手套，抓住大鼠的尾中部或根部从笼具中取出后立即置于笼盖或实验台上。 右手抓住大鼠尾根部，将大鼠置于笼盖或其它粗糙表面上，其它粗糙表面上，轻轻向后拉尾。 当大鼠向前爬行时，用左手食指和中指夹住大鼠颈部，同时拇指和无名指滑向其左右腋下，分开前肢，拿起动物反转为仰卧位，即可进行实验操作。,豚鼠的实验方法,家兔的抓取方法,兔的抓取保定： (一) 方法1： 步骤： 1、用右手把兔的两耳拿 在手心并抓住颈后部皮肤， 把兔提起。 2、然后用左手托住兔 的臀部。,方法2： 器材：兔保定架1个。 步骤： 1、打开保定架的上盖，抓取并将兔放进架 内，迅速关上保定架的上盖。 2、右手抓住兔耳朵将头部拉过保定架的卡 栓，将兔的脖子保定。 3、如果兔挣扎，可用手 在它的背上轻轻抚摸， 使其安静。,家兔的兔台固定方法,猫的抓取与固定方法,比格狗照射固定架,钳式长柄捕狗夹,驯服动物的固定,猪固定在木制三角架上,布制猪固定带,猪的悬吊式固定,猕猴的抓取,猕猴的抓取,猪的强制性固定,猕猴固定架,猕猴固定架,猕猴的固定,猕猴的固定,猕猴的固定与后肢静脉血的抽取,动物实验的基本检查 基本检查的目的是保证实验用动物均正常。 一般检查 实验前通过对动物的外观、活动、食欲、体温、脉博和呼吸等生命体征的观察和检查，对实验动物进行初步筛选。 特殊检查 实验前对动物进行血象、生化及血压、心电图、射线透视等检查。,各种成年动物的正常体温(直肠温度，) 动物名称 体温() 动物名称 体温() 猿、猴 38.6 大鼠 39.0 狗 39.0 小鼠 38.0 猫 38.7 鸡 41.7 家兔 39.0 鸽 42.0 豚鼠 38.6 猪 39.0,家兔体温检查方法,用家兔进行热原检测,气温与家兔体温的关系 气温() 家兔体温() 5 37.5 10 38.0 20 38.7 35 40.5 40 41.6,实验用动物的体重要求 动物 体重(kg) 狗 1015 猴 35 兔 22.5 豚鼠 0.450.70 大鼠 0.180.25 小鼠 0.020.03,正常动物每分钟脉搏次数 动物 脉搏次数(次/分) 猪 6080 羊 7080 狗 80120 兔 120150 豚鼠 230350 大鼠 200360 小鼠 520780,正常动物每分钟呼吸次数 动物 脉搏次数(次/分) 猪 15(1218) 羊 30(2040) 狗 18(1030) 兔 60(5080) 豚鼠 120(100150) 大鼠 120(100150) 小鼠 150(140160),实验动物的给药方法 为了观察药物对机体功能、代 谢、形态的影响，需要将药物注入实验动物体内。由于实验目的、动物种类、药物剂型不同，给药途径和方法也多种多样。,实验动物的给药剂量,D2=D1K2/K1 3 W1/W2 D:药物剂量(gkg-1d-1) W:动物体重(kg) K:常数,不同种类动物的K值,名称 K值 名称 K值 人 10.6 家兔 10.1 猴 11.8 大鼠 9.1 狗 11.2 豚鼠 9.8 猫 9.8 小鼠 9.1,经口给药剂量准确，对动物安全，是动物实验中常用的给药方法，尤其是移植实验中受体动物的肠道灭菌处理，必须口服肠道不吸收的抗生素。,口服给药,大白鼠灌胃方法,方法步骤： 1、将灌胃针连接在注射器上，吸入一定量的药液。 2、左手捉持保定大鼠，右手将灌胃针头尖端放进大鼠口咽部，顺咽后壁轻轻往下推，灌胃针会顺着食管滑入大鼠的胃内将注灌胃针插入约5cm。 3、用右手食指将针栓慢慢往下压，将注射器中的生理盐水灌入大鼠的胃中。 剂量：0.010.02mlg体重。 注意：在灌胃过程中，避免误插入气管。,小白鼠灌胃方法,兔灌胃用张口器及胃管,步骤： 1、将兔放进保定架内，助手用手轻轻压住兔的背部，避免兔的挣扎。 2、灌胃者用在手拇指和中指挤压兔两颊，将下颌挤开使兔被动张口。 3、右手将开口器从一侧口角插入口腔并 固定。 4、用泡在石蜡油中的胃管，经开口器的 孔插入，向前推进约15cm，可达胃内。,5、在插管时应将胃管另一端泡在水中 确认没有冒气泡，即可用注射器经 胃管注入药液。 灌胃量： 80-150ml只次。 注 意：在灌胃过程中， 避免误插入气管。,兔灌胃方法,狗灌胃方法,猪灌胃方法,注射给药 注射给药剂量准确,作用快,是动物实验中常用的给药方法。给药时应注意针头号码的选择(鼠类-4#,狗-6#，马-9#)。,皮下注射 原理：将药液注入皮下结缔组织，经毛细 血管、淋巴管吸收进入血液循环。,器材：5ml注射器1支、生理盐水、烧杯、 酒精、碘酒、棉球。,皮下注射,皮下注射,方法步骤： (1) 注射部位：选大鼠的项背部的皮下。 (2) 常规消毒注射部位的皮肤，用注射针头取一锐角角度刺入皮下。 (3) 将针头轻轻向左右摆动，易摆动则表示已刺入皮下，再轻轻抽吸，如无回血，可缓慢地将药物注入皮下。 注射量：0.01mlg体重。,皮内注射,小鼠腹腔注射方法,小鼠尾静脉注射方法,小鼠尾静脉注射方法,狗前肢内侧皮下静脉注射方法,狗后肢静脉注射方法,各种动物一次给药能耐受的最大容量(ml) 动物 灌胃 皮内注射 皮下注射 肌肉注射 腹腔注射 静脉注射 小鼠 0.9 0.1 1.5 0.2 1.0 0.8 大鼠 5.0 0.1 5.0 0.5 2.0 4.0 兔 200 0.2 10 2.0 5.0 10 猫 150 0.2 10 2.0 5.0 10 猴 300 0.3 50 3.0 10 20 狗 500 0.3 100 4.0 _ 100,样本采集 及时、准确地采(收)集实验动物的血样或排泄(分泌)物等实验标本，是保证动物实验结果是否准确的重要条件。动物实验中一个样本有时可提供10多个数据，采集不当时可严重影响实验结果，如狗或猴在实验台上较长时间剧烈挣扎后可使外周血白细胞明显升高；如抽血不顺利且时间较长，采集的血样中血小板计数可明显降低。,血样的采集 根据不同的实验要求及不同种类的实验动物而采取不同的采血方法。 心脏 胸主动脉 股动脉 静脉 剪(割、刺)尾 眼眶 断头,鼠尾静脉切割方法,鼠尾静脉取血方法,小白鼠后眼眶静脉丛取血方法,大白鼠后眼眶静脉丛取血方法,小鼠的采血 摘除眼球采血法： 原理：将小鼠的眼球摘除后取血液 的方法。 器材：眼科弯镊、试管。,方法步骤： (1)左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实 验台上，取侧卧位; (2)左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈 后压，使眼球突出。,(3)用眼科弯镊夹去眼球，将鼠倒立， 用试管接住流出的血液。 (4)采血完毕立即用纱布压迫止血。 采血量：每次0.6-1.0ml/次。,小白鼠心内取血方法,大白鼠颈静脉取血方法,兔耳缘静脉或兔耳中央动脉穿刺 方法步骤： (1) 将兔放在保定架内保定。 (2) 酒精消毒并揉搓血管， 使兔的耳缘静脉或耳中央动 脉充盈。,(3) 用左手食指和中指夹住兔的耳缘静脉或 耳中央动脉近心端，拇指和小指夹住耳郭边 缘部分，无名指和小指放在耳郭下作垫。 (4) 右手拿注射器，针尖的斜面朝上，将针 头插入血管，放松对静脉近心端的压迫，缓 慢把地药液注射进血管，或将血液抽出来。 注射或采血量：5一10ml。,兔耳中央动脉取血方法,兔耳缘静脉取血方法,狗颈静脉取血方法,狗股动脉取血方法,猕猴后肢静脉取血方法,肝素:1ml血液内加入20国际单位肝素(1mg等于120单位，市售肝素钠注射液12500单位/2ml约为50mg /ml)即可达到抗凝目的，可将肝素配制成500单位/ml置4保存，或于试管内加入100单位肝素液后于80烤干备用，后者可抗凝35ml血液。 草酸盐合剂(草酸胺1.2g,草酸钾0.8g,甲醛1.0ml) 0.1ml、5%枸橼酸钠液0.1ml、2%草酸钾溶液0.1ml均可使1ml血液抗凝。2.7%EDTA 0.5ml可使10ml血液抗凝。,抗凝剂的应用,消化液采集 (一)胃液的采集 通过刺激，使胃液分泌增加，再用插胃管的办法抽取胃液。 (二)胆汁的采集 采集胆汁需要施行手术。 (三)胰液的采集 胰液的采集基本同胆汁的采集。,尿液采集 (一)代谢笼 动物排便时，可通过笼子底部的大小便分离漏斗，将尿液与粪便分开，达到采集尿液的目的。 (二)压迫膀胱(强制排尿) 将动物固定，按压骶骨两侧的腰背部或轻轻压迫膀胱的体表部位，使其排尿。,处死 安乐死:使动物在尽短大时间内没有痛苦没有恐惧地死亡大方法. 原则：时间短、痛苦少,处死方法 化学药物：二氧化碳，三氯甲烷 乙醚，氯化钾，乙醇 脱臼断髓：颈椎脱臼 空气栓塞：兔40ml,狗100ml 急性失血：大动物麻醉 股动脉放血,小鼠颈椎脱臼处死法,动物实验后的管理方法,一、动物实验后的护理 (一)注意饮食卫生 (二)细心护理，防止意外损伤 (三)控制好受试动物的环境,二、动物实验的描述 (一)标题中实验动物种名的记述 论文题目是该项研究的核心。许多情况下，应描述实验动物的种（品系）名。,(二)实验动物的品种(系) 应准确描述实验动物的品种或品系名称，避免使用通俗称谓。 (三)实验动物的来源、遗传背景及微生物学质量 动物从何处获得属于遗传学分类（近交系、突变系封闭群、杂交群）中的哪一类，属于微生物学质量分级（普通级、清洁级、SPF级、无菌级）中的哪一级，必须规范叙述。,(四)动物性别 动物性别对某些实验结果影响较大，因此必须描述动物的性别。 (五)动物年龄、体重 实验者应向实验动物供应单位索取，询问清楚。 (六)动物饲养方式 应对动物饲养方式，如饲料种类、饲料来源、饲料合格证号、饲喂方式、饮水方式、饲养密度、笼具与垫料种类、更换次数、清扫频率，甚至使用哪一种材料的笼盒都应叙述清楚。如若是因实验需要自制的饲料，应叙述饲料成分和配制方法等。,(七)实验环境 实验观察环境（如温度、湿度、光照度、光照周期、噪音、环境洁净度）、动物饲养环境的级别以及相应级别的动物实验条件合格证号码与颁布单位等应作出尽可能的描述。如若是清洁级以上的条件，还应叙述换气次数。 (八)实验动物和动物实验条件合格证 目前我国实施实验动物合格证制度，并以法令形式作出规定。实验者在论文中应记述所使用动物和动物实验条件的合格证号码及颁发合格证的单位。,(九)使用的麻醉剂 动物施行麻醉术时，有些实验应记述所使用的麻醉剂种类、剂量、麻醉方式和给药途径等。 (十)施加实验因素所采用的方式 如“经口灌胃”、“腹腔注射”等。 (十一)处死方法 在有些需处死后采集标本的实验中，应标明动物的处死方式。,动物实验后废弃物的无害化处理,一、组织管理 在各单位实验动物管理委员会的指导下，所属的动物实验中心（或室）对废物的无害化实行专人领导和专人负责制，并制定相应的规章制度强化动物实验中的废弃物的无害化处理的管