叶绿素荧光研究技术.ppt

叶绿素荧光分析技术在植物生理生态研究中的应用,Kautsky and Hirsh（1931）发现，将暗适应的绿色植物突然暴露在可见光下后，植物绿色组织发出一种暗红色，强度不断变化的荧光（Kautsky效应）。 荧光随时间变化的曲线称为叶绿素荧光诱导动力学曲线。,叶绿素荧光现象的发现,上世纪80年代，gren（1985）和Schreiber（1986）相继创制出便携的调制式荧光仪，并实现了商品化。,叶绿素荧光动力学研究得到广泛应用的原因 1、叶绿素荧光动力学特性包含着光合作用过程的丰富信息 光能的吸收与转换 能量的传递与分配 反应中心的状态 过剩光能及其耗散 光合作用光抑制与光破坏等等 2、可以对光合器官进行“无损伤探查”，获得 “原位”的（in situ）信息。 3、操作步骤简单快捷。,由于以上原因 叶绿素荧光动力学技术在： 光合作用生理生态 逆境生理 等研究领域得到了较快的普及和广泛的应用,直观的叶绿素荧光现象 叶绿素溶液在投射光下呈绿色，在反射光下呈红色的现象。 荧光现象的本质是什么？为什么活体植物的叶片看不到荧光现象？,叶绿体吸收光后，激发了捕光色素蛋白复合体（LHC），LHC将其能量传递到光系统2或光系统1。其间所吸收的光能有所损失，大约3%-9%的所吸收的光能被重新发射出来，其波长较长,也即叶绿素荧光 .,透射光下,反射光下,当一个叶绿素分子a的电子从激发态回到到基态的去激过程中，一小部分激发能（3-9%）以红色的荧光形式耗散。,在生理温度下，叶绿素荧光的波长峰值大约为685nm的红光，并且一致延伸到800nm的远红光处,荧光是研究光能分配的探针,通过调节PSII反应中心的开放的程度干涉荧光的发射，根据不同情况下荧光的变化来分析光合机构运行情况。,F:叶绿素荧光产量；kf： 叶绿素荧光的速率常数；kp：光化学反应的速率常数；kd：热耗散的速率常数,荧光发射与原初光化学活动、热耗散过程是互相竞争的一种关系。因此，荧光产量的变化反映了光化学效率和热耗散能力的变化。,如何测定叶绿素荧光？ 现有两类荧光仪可以用来测定叶绿素荧光。 1.续激发式荧光仪（如PEA)，必须将测定叶片在避光下测定，在照光条件下，仪器无法区分叶绿素荧光和自然光中与荧光波长相同的红光和远红光。 但是这类荧光仪有很高的分辨率，每秒钟能够测定10万次荧光变化，因此是研究光合机构中电子传递瞬间变化的有力工具。,2.脉冲调制式荧光仪（如FMS-2)，可以避免上述问题。在测定时，仪器提供一种脉冲调制式光，能诱导出的脉冲式的荧光。当有其它光线同时存在时，会产生以下三种光信号： 1.自然光中具有荧光波长的红光信号 2.自然光诱导的非脉冲荧光信号 3.脉冲调制光诱导的脉冲荧光信号,脉冲调整式叶绿素荧光仪原理图,1：调制测量光； 2：作用光； 3：饱和脉冲光； 4：远红光； 5：检测器及放大器； 6：短波通过滤光片； 7：长波通过滤光片； 8：样品,（5）,（6）,7）,8,高选择性监测器可以排除前两种信号而只保留脉冲过程中所产生的荧光信号。用脉冲调制式方法，可以在全光照情况下测量叶绿素荧光信号，而不被其它光所干扰。,当对暗适应叶片照光时，叶绿素荧光迅速上升，随后有一系列的慢的波动，逐渐下降到稳态。这称为“Kautsky Effect”，是Kautsky等在1931年首先报道的。 荧光产量的变化反映了光化学效率和热耗散能力的变化。,将时间标尺放大后的荧光动力学曲线,对（Kautsky Effect）的解释 ：连续光下荧光产量瞬态上升，这是因为照光后某些碳同化酶需要光活化，因此碳同化途径产生延迟。这使得照光初期相当多的QA处于还原状态，从而导致了荧光产量的瞬态上升。这之后，由于光化学过程和热耗散过程的发生，荧光产量产生淬灭到一个稳态数值（Ft）。,暗反应,光活化过程,X Pheo Q Fd PQ NADP Cytf O2 PC P700 光 量 子 H2O Z P680 光 量 子,光 合 电 子 传 递 链,Fv/Fm =(Fm-Fo)/Fm ； qP=(Fm-Ft )/(Fm-Fo) ； PSII =(Fm-Ft )/Fm ； NPQ =(Fm-Fm)/Fm ；qNP= (Fm-Fm)/(Fm-Fo),t,(Fs),主要荧光参数及其意义 Fo： 初始荧光产量（Original fluorescence yield ）也 称基础荧光，是PS反应中心（经过充分暗适应以后）处于完全开放状态时的初始荧光产量。 Fm：最大荧光产量（Maximal fluoreseence yield ）， 是PS反应中心完全关闭时的荧光产量。通常叶片经暗适应20min后测得。 Fv=Fm-Fo：可变荧光，反映PS的电子传递最大潜力。经暗适应后测得。,Fv/Fm：暗适应下PS反应中心完全开放时的最大 光化学效率，反映PS反应中心最大光能 转换效率。 Fv/Fo：代表PS潜在光化学活性，与有活性的反 应中 心的数量成正比关系。 Fo： 光适应下初始荧光。 Fm： 光适应下最大荧光。 Fv=Fm-Fo：光适应下可变荧光。 Fv/Fm：光适应下PS最大光化学效率，它反映有 热耗散存在时PS反应中心完全开放时的 光化学 效率，也称为最大天线转换效率。,Ft(或Fs ): 稳态荧光产量 steady-state fluorescence yield。 PS=(Fm-Fs)/Fm ： PS实际光化学效率，它反 映在照光下PS反应中心部分关闭的情况下的 实际光化学效率。 qP =(Fm -Fs)/(Fm-Fo) ： photochemical quenching 光化学猝灭系数，它反映了PS反应中心的开 放程度。 1- qP 用来表示PS反应中心的关闭程度。,qNP =(Fm-Fm)/(Fm-Fo) ：非光化学猝灭系数 NPQ = (Fm-Fm)/Fm Fm/Fm-1 ：非光化学猝灭 non-photochemical quenching ETR = PS absorbed PFD 0.5 ：PSII电子 传递 速率,Relationship between PSII and CO2 in maize leaves grown in the field at different dates.,荧光参数是研究植物光化学效率、 光抑制与光破坏防御的有效的工具 该技术被广泛的使用在植物生态、植物抗逆性、筛选高光效或抗逆品种、转基因植物的功能分析、光抑制和光破坏的防御机制等方面的研究。,光抑制概念: 强光造成光合功能下降的过程称为光抑制 特征：光合效率下降；Fv/Fm 及AQY 下降 过去人们把光抑制与光破坏等同起来，认为发生了光抑制就意味着光合机构遭到破坏。甚至把光抑制 、光破坏、光漂白、光氧化等概念通用。,光抑制: photoihibition 光氧化: photooxidation 光钝化: photoinactivation 光破坏: photodamage 光破坏: solarigation 光漂白: photobleaching,光抑制的基本特征 AQY及Fv/Fm下降. 说明叶片吸收的光能不能有效地转化为化学能。 光抑制的机理 光合机构的破坏。PSII是光抑制损伤的主要场所，破坏也可能发生在反应中心也可能发生在与次级电子受体结合的蛋白上。发生光破坏后的结果：电子传递受阻，光合效率下降。 产生光破坏的原因： 过剩光能产生的高能电子无法利用，产生如 chl*, 单线态氧、超氧阴离子等氧化性很强的分子破坏光合机构。,光破坏的概念,当过剩的光能不能及时有效地排散时，对光合机构造成不可逆的伤害，如对光合色素造成光漂白、光合作用中心D1蛋白的降解及光合机构的光氧化等。,3P680 + O2 P680 + 1O2 氧化性极强的1O2首先攻击反应中心色素P680，使PS反应中心失去电荷分离能力，最终引起D1蛋白降解.PS受体侧电子传递受阻时易产生此种破坏。 Fd + O2 Fd + O2 O2。启动类囊体膜的脂质过氧化，破坏光合色素、类囊体系统以及膜结合酶使电子传递效率下降，严重时使电子传递系统失活。 P680+ + -Car P680 + -Car+ PS供体侧 H2O的光解受阻时易产生此种破坏。P680+还能氧化D1蛋白肽链中酪氨酸残基和叶绿素等色素。,激发态叶绿素的4种去激发途径,一切影响CO2同化的外接界因素如低温、高温、水分亏缺、矿质元素亏缺等都会减少对光能的利用，、导致过剩光能增加，进而加重光破坏。,激发能,光化学反应形成同化力,热耗散,荧光,光破坏防御机制,CO2固定 光呼吸 Mehler 反应 N代谢,植物防御光破坏的措施 1 减少对光能的吸收 增加叶片的绒毛、蜡质 减少叶片与主茎的夹角 2 增强代谢能力 碳同化 光呼吸与活性氧清除系统 氮代谢 Mehler反应与活性氧清除系统,3. 增加热耗散 依赖叶黄素循环的热耗散 作用中心可逆失活 状态转换,第一道防线：天线热耗散（又称“高能态耗散”）此类热耗散依赖于： （1）类囊体膜内外的pH梯度（非环式电子传递、假环式电子传递和环式电子传递均可加大pH梯度） （2）叶黄素循环,光合机构处理过剩激发能的方式,依赖于叶黄素循环的热耗散 叶黄素循环的运转被跨膜pH促进，此外叶黄素循环库在强光下明显增大。 叶黄素循环耗散过剩光能的机理： 玉米黄质的直接作用（猝灭三线态叶绿素）； LHCII色素蛋白复合物与叶黄素各自形成聚集态并互相靠近，有利于过剩光能的热耗散。,VDE：紫黄质脱环氧化酶,天线热耗散的最大特点是在过剩光能尚未引起PSII反应中心电荷分离之前，就在天线中将其耗散，这种对过剩激发能处理的方式 一是安全可靠 二是反应快速, 第二道防线：反应中心耗散 主要是通过PSII反应中心的可逆（或不可逆）失活，使一部分PSII反应中心由原来的光能转化中心变为过剩光能耗散中心，但是，这种耗散方式实际上已经使一部分PSII复合体受到暂时的或永久性的损伤。 是光抑制的狭义的概念。,PSII反应中心可逆失活的特点 PSII的失活可能与天线的脱离有关。 正常的PSII反应中心位于基粒类囊体膜，电子传递功能正常； 失活的PSII反应中心位于间质片层膜，不能还原QB，失活反应中心的Fo增高，Fm降低。 失活的反应中心可以修复，涉及D1蛋白的磷酸化。 失活反应中心可形成围绕PSII的循环电子流（P680PheoCyb559P680）,电子进行无效循环。,第三条防线:状态转换 光合机构通过可逆磷酸化,调节PSII捕光色素复合体(LHCII)的捕光量,从而实现激发能在两个光系统间均衡分配的过程。 能量满溢（PSII向基粒边缘的PSI靠近）,强光下，PSII吸收过多激发能（状态II） PQ处于过度还原态 蛋白磷酸激酶被激活 LHCII磷酸化 LHCII与PSII反应中心脱离，向PSI靠近 PSII捕光截面变小，PSI捕光截面变大,用荧光动力学曲线区分过剩光能耗散的不同方式 可将非光化学猝灭qNP区分为三部分： qNPqE+qT+qI qE高能态荧光猝灭 qT与状态转换有关的荧光猝灭 qI 与光抑制有关的荧光猝灭, 暗驰豫时间：qE40min, 第四道防线：活性氧清除 通过以上两道防线仍未被耗散掉的激发能，可能在PSII中转移给O2而形成1O2，或以激发态电子的形式在PSI受体端交给O2而形成氧自由基O2- 这时便需要通过酶促的或非酶促的途径将活性氧加以清除。,Mehler过氧化反应（水水循环）,叶绿体中活性氧清除酶系,以上四道防线可以对过剩激发能进行层层阻截，以减轻其危害。 但是，当强光与多种逆境同时存在、这四条途径未能奏效的情况下，将不可避免地产生大量活性氧，造成光破坏。 最常见的结果D1蛋白的破坏，更加严重的是叶绿素和类胡萝卜素的降解，使叶片发生“光漂白”。,由此也便不难理解，为什么在黑暗中逆境对植物的危害较小，而在光下危害较重，而且光照愈强，逆境危害愈重； 此外，处于衰老阶段或长期在弱光下生长的作物对强光十分敏感。这正是植物体内过剩激发能的生成与光合器对同化力的利用和对过剩激发能的处理两方面相互较量的结果。 这也正是不同种类的逆境胁迫对植物危害机理的共同性之所在。,热耗散过程虽然能耗散过剩光能,保护植物不被强光破坏,但却不可避免地降低了光化学效率,按传统的观点凡是导致光化学效率降低的过程都称为光抑制。 由此可见,光破坏的防御机制也是光抑制的一种形式,实际上在自然条件下,大多数的光抑制都是由光破坏防御机制造成的。,激发能,光化学反应形成同化力,热耗散,荧光,如何区分光破坏与热耗散 ? 荧光是研究光能分配的探针,CO2固定 光呼吸 Mehler 反应 N代谢,NPQ 增加、Fm下降是热耗散增加的标志； Fo升高是作用中心破坏的标志,叶绿素荧光分析应用实例,NaCl胁迫对杂交酸模叶片光化学猝灭系数（qP）、PSII反应中心光能捕获效率（Fv/Fm）、和PSII量子效率(PSII)的影响,A：光化学猝灭系数（qP） B：光能捕获效率（Fv/Fm） C：PSII量子效率(PSII),对照叶片和盐胁迫叶片光化学猝灭系数（qP）、PSII光能捕获效率（Fv/Fm）、PSII量子效率(PSII，)、非光化学猝灭(NPQ，D)对温度的响应。示NaCl处理增加叶片的抗高温能力,，对照； ，200 mmol/L NaCl,Ca2+ 对不同浓度NaCl胁迫下杂交酸模叶片光化学猝灭（qP），PSII反应中心光能捕获效率（Fv/Fm）和PSII光量子效率(PSII, )的影响,： ck ： 8 mmol/L Ca2+,Ca2+ 对NaCl胁迫下杂交酸模叶片PSII光化学反应的影响,图9 高温（42, 24h）处理前后阴生和阳生玉米叶片PSII 、Fv/Fm，qP对光强的响应,高温对不同叶龄沙地榆叶片Fo、Fm的影响,强光下对照与缺锰叶片PSII实际光化学效率（PSII）和电子传递速率（ETR）和光化学猝灭qP的变化。,不同温度下、强光对玉米叶片最大光化学效率的影响,低温和低温弱光胁迫下甜椒Fv/Fm的响应及其随后的恢复。恢复条件为25 C和100 mol m-2 s-1光强。 ，低温弱光胁迫；，低温黑暗胁迫。,低温弱光胁迫对甜椒叶片线性电子传递的影响 ，对照； ，低温弱光胁迫（4 和100 mol m-2 s-1光强）； ，MV处理（4 和100 mol m-2 s-1光强）；，AsA处理（4 和100 mol m-2 s-1光强）,经1200molm-2s-1强光及不同浓度PEG处理4小时后， 不同节位大豆离体叶片Fv/Fm、PSII、Prate、及NPQ的变化,田间大豆不同节位离体叶片的Fv/Fm、及PSII在40下对强光（1200mol）及弱光（400mol）的反应以及随后的暗恢复过程,PFD20,PFD20,PFD400,不同年代玉米品种果穗叶PS在衰老过程中的变化,不同年代玉米品种果穗叶qE在衰老过程中的变化,不同年代玉米品种果穗叶qT在衰老过程中的变化,不同年代玉米品种果穗叶qI在衰老过程中的变化,叶绿素荧光用于能量分配的研究,长期干旱(D)、淹涝(W)及正常浇水(CK) 大豆倒数第1、4、7位叶片光合日变化,1st node,4th node,7th node,长期干旱及淹涝胁迫大豆叶绿素荧光参数的日变化的比较,长期干旱及淹涝胁迫大豆一天 中对吸收光能分配的平均值及中 午时对吸收光能的分配,叶片由黑暗转入强光后叶绿素荧光的猝灭过程,叶绿素荧光用来研究光合机构在光下的启动过程,结荚期大豆功能叶和老叶Pn、Gs、对强光的响应,由黑暗转入强光后，不同叶龄大豆叶片PS、NPQ等的变化,充分暗适应栽培大豆()和野生种大豆() 叶片由黑暗转到1200molm-2s-1光强下，净光合速率(Pn), 气孔导度（Gs) 和PSII光化学效率（PSII）对光强的响应。,快速叶绿素荧光诱导动力学的应用 O，I,J,P 分析,O，I,J,P 曲线包含巨大的信息，是研究植物光合机构功能的有力工具,New approach developped by Prof. Reto Strasser -Geneva University, Bioenergetics Lab.,JIP test application and theory of energy flux,叶绿素荧光诱导动力学曲线,从O点到P点的荧光上升过程称为快速叶绿素荧光诱导动力学曲线，主要反映了PS的原初光化学反应及光合机构的结构和状态等的变化。 从P点到T点的下降阶段主要反映了光合碳代谢的变化，随着光合碳代谢速率的上升，荧光强度（T）逐渐下降。,叶绿素荧光诱导动力学曲线的意义,调制式荧光荧光仪：FMS-1、FMS-2、PAM等（主要用来研究叶绿素荧光诱导动力学曲线的下降阶段，即光合作用的暗反应） 连续激发式荧光仪：PEA、HandyPEA、PEA Senior（主要用来研究快速叶绿素荧光诱导动力学，即光合作用的光反应）,研究叶绿素荧光诱导动力学曲线的主要手段,测定O-J-I-P荧光诱导曲线的仪器及方法,PEA植物效率分析仪,Handy PEA,PEA Senior,典型的快速叶绿素荧光诱导动力学曲线（O-J-I-P荧光诱导曲线）,光合机构中原初光化学反应的简单模型,O-J-I-P荧光诱导曲线的意义,O：PS的电子受体（QA、QB、PQ等）处于最大程度氧化态时的荧光，最小荧光。O点时电子受体主要状态：QAQBPQ 。O相的荧光强弱与反应中心色素含量的多少及组成有关。 J：PS的电子受体QA第一次处于瞬时最大程度还原态时的荧光。J点时电子受体主要状态：QAQB-，QA-QB-。 Yz P680 QA QB PQ,I：反应了PQ库的异质性,即快还原型PQ库和慢还原型PQ库的大小。I点时电子受体主要状态：QA-QB2-。 P：PS的电子受体（QA、QB、PQ等）处于最大程度还原态时的荧光，最大荧光。 P点时电子受体主要状态：QA-QB2-，PQH2。 Yz P680 QA QB PQ,苔藓脱水过程中O-J-I-P荧光诱导曲线的变化,玉米缺铁后O-J-I-P荧光诱导曲线的变化,不同逆境下O-J-I-P荧光诱导曲线的变化,烟草叶片高温处理后O-J-I-P荧光诱导曲线的变化,大豆叶片衰老后O-J-I-P荧光诱导曲线的变化,JIP-test理论基础：生物膜能量流动,高度简化的生物膜能量流动模型图,JIP-test分析的部分参数,58 parameters,Drought: 8.6.2004 Winter Wheat,Viginta Ilona Pobeda Arida Eva Stephens BU-9,Drought: 11.6.2004,Viginta Ilona Pobeda Arida Eva Stephens BU-9,杂交酸模（RumexK1）功能叶（G）衰老叶（S）O-J-I-P荧光诱导曲线参数的比较,杂交酸膜叶片展开过程中FV/FM和PIABS的变化,Fv/Fm相同时不同高温下大豆叶片O-J-I-P荧光诱导曲线的变化,不同高温下大豆叶片OEC活性的变化,大豆叶片不同温度处理后有活性的反应中心能量耗散效率的变化,高温处理后杂交酸膜叶片能流动的变化,specific fluxes (membrane model),phenomenological fluxes (leaf model),灰霉病菌侵染的黄瓜叶片和对照叶片的第0天处理前（A）、第10天（B）、第15天（C）快速叶绿素荧光诱导动力学曲线变化,灰霉病菌侵染的黄瓜叶片后对荧光参数WK的变化。 示光合机构放氧复合体(OEC)的破坏,与调制式荧光仪相比，连续激发式荧光仪有很多优点，获得信息量大、操作简便快捷、易于大量重复、便携、存储量大、价格便宜。,对照叶片和盐胁迫（200 mmol/L）叶片 QB-非还原性PSII反应中心相对含量在热胁迫过程中的变化。 示盐胁迫增加的叶片对高温的抵抗能力,，对照； ，200 mmol/L NaCl,随着光合理论的发展，叶绿素荧光动力学特别是快速叶绿素荧光诱导动力学获得了迅猛的发展并日趋完善。由于具有快速和非破坏性的优点，快速叶绿素荧光诱导动力学目前不仅在植物生理研究中被广泛应用，它已深入到许多其它领域和应用部门，如遗传育种、病虫害防治及污染检测等。,我们研究室近几年来利用荧光仪发表的部分论文,1. Ye Liang ,Gao Hui-yuan and Zou Qi, (2000) Responses of the antioxidant systems and xanthophyll cycle in Phaseolus vulgaris to the combined stress of high irradiance and high temperature. Photosynthetica, 38(2): 267-271 2. Jiang Chuang-dao, Gao Hui-yuan and Zou Qi, (2001) Enhanced thermal energy dissipation depending on xanthophyll cycle and D1 protein turnover in iron-deficient maize leaves exposed to high light. Photosynthetica, 39(2): 269-274 3. Jiang Chuang-dao, Gao Hui-yuan and Zou Qi, (2002) Characteristics of photosynthetic apparatus in Mn-starved leaves. Photosynthetica, 40(2): 209-213 4. Jiang Chuang-dao, Gao Hui-yuan and Zou Qi, (2003) Changes of donor and acceptor side in photosystem 2 complex induced by iron deficiency in attached soybean and maize leaves. Photosynthetica, 41(2): 267271 5. Jiang Chuang-dao, Gao Hui-yuan , Zou Qi and Jiang Gao-ming (2003) Effects of streptomycin treatment on the chlorophyll fluorescence parameters and the level of the xanthophyll de-epoxidation in maize leaves. Journal of Plant Physiology and Molecular Biology, 29(3):221-216,6. Jiang Chuang-dao, Gao Hui-yuan , Zou Qi and Jiang Gao-ming (2003) Imbalance in Excited Energy Distribution Between Two Photosystems Induced by Feeding Dithiothreitol to Soybean Leaves. Journal of Plant Physiology and Molecular Biology, 29(6):561-568 7. Jiang Chuang-dao, Gao Hui-yuan , Zou Qi and Jiang Gao-ming (2004) Characteristics of Photosynthesis and Photoprotective Mechanisms During Leaf Development of Soybean Plants Grown in Field. Journal of Plant Physiology and Molecular Biology, 30(4): 11. Chen Hua-xin, Gao Hui-yuan, Li Wei-jun and An Sha-zou, (2004) Dissipation of excess energy in Mehler-Peroxidase reaction in Rumex leaves during salt shock, Photosynthetica, 42(1):117-122 12. Chen Hua-xin, Gao Hui-yuan, Li Wei-jun and An Sha-zou, (2004) NaCl Stress Increases the Heat tolerance of PSII in Leaves of Rumex K-1 Seedlings. Journal of Plant Physiology and Molecular Biology, 30 (3): 345-350