实时荧光定量PCR介绍.ppt

August 8, 2019,实时荧光定量PCR介绍,宝生物工程（大连）有限公司,主 要 内 容,Real Time PCR基础知识,Real Time PCR的用途,Real Time PCR的原理,使用Real Time PCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。,Real Time PCR,Real Time PCR基础知识,TaqManProbe,Cycling Probe,Molecular Beacon,etc.,SYBR Green I,荧光染料嵌合法,荧光探针法,Real Time PCR的检测方法,荧光染料嵌合法（SYBR Green I）,SYBR Green I：是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的 具有绿色激发波长的染料。,SYBR Green I,F,SYBR Green I 法作用机理示意图,TaqMan法作用机理,TaqMan探针为一寡核苷酸， 5 端标记一个报告基团（Reporter）， 3 端标记一个淬灭基团（Quencher）。,Q,TaqMan Probe法原理示意图,SYBR Green I 法与Probe法比较,常用于mRNA表达量分析等,SYBR Green I 法,简便易行,价格便宜,要求反应的特异性,不能进行多重PCR,常用于SNP解析，病毒、病源菌检测,主 要 内 容,RT Primer的选择,Random Primer Oligo dT Primer Gene Specific Primer,Random 6mer Primer,Gene Specific Primer,Oligo dT Primer,PCR R-Primer,PCR F-Primer,RT Primer的选择,Real Time PCR引物设计,目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。,目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。,Real Time PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同,= 对引物设计要求严格,普通PCR引物,Real Time PCR引物,Real Time PCR引物设计原则,Real Time PCR用TaqMan探针设计原则,Real Time PCR探针设计原则,线性关系、扩增效率确认,检测灵敏度确认,PCR扩增效率（E）：0.8-1.2,35Cycles内可得到好的定量结果。 如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增。,相关系数（r2）：大于0.98,反应性能确认,主 要 内 容,标准曲线制作,扩增曲线,标准曲线,标准品梯度的选择：56个梯度 标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为10,105 104 103 102 101 100,105 104 103 102 101 100,标准品的种类,质粒标准品构建流程,基因组DNA,PCR,目的基因克隆,目的基因,目的基因,目的基因,质粒,质粒提取，OD值定量。将质粒梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。,体外转录RNA标准品构建流程,RNA纯化后，测OD定量。将RNA梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。,T7 RNA polymerase,体外转录RNA,Total RNA,PCR,cDNA,RT,T7 Promoter,TTTTT,PCR产物,目的基因,目的基因,目的基因,AAAAA,AAAAA,理想的标准品扩增曲线,基线平整 Negative Control为水平线 指数区较明显，陡度大 平台区汇于一起 线性范围宽,理想的标准曲线,相关系数（r2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.8-1.2，越接近1，越理想。,扩增效率,相关系数,扩增效率（E）计算方法,标准曲线X轴表示起始模板浓度（log10)，Y轴表示Ct值时 E=10-1/a-1 标准曲线X轴表示Ct值，Y轴表示起始模板浓度（log10) E=10-a-1,Real Time PCR解析方法,融解曲线分析,Tm值是指双链DNA分子解链一半时的温度。,SYBR Green I 法进行检出时， 要根据融解曲线确认PCR产物的特异性。,特异性产物,非特异产物,引物二聚体,对PCR产物特异性进行分析,融解曲线分析,Real Time PCR解析方法,绝对定量解析方法,提取样品,引物设计,标准品制备,Real Time PCR反应,数据分析,流 程,绝对定量解析方法,通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷贝数或浓度。通常应用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。,105,104,103,101,扩增曲线图,标准曲线图,检测样品,检测样品,102,相对定量解析方法,以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）校正， 进行相对表达量分析。,进行相对表达量分析必要性,实际上目的基因表达量分析,相对定量解析方法,管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、-actin等。,筛选方法,根据文献提供 通过具体实验筛选,主 要 内 容,绝对定量应用例 对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量,检测方法 TaqMan probe 法 检测样品 3个从SARS样品中提取的Total RNA 目的基因 SARS病毒RNA 内 参 SARS Internal Control RNA 标 准 品 SARS Control RNA 试 剂 One Step PrimeScript RT-PCR Kit （Perfect Real Time）（DRR064） 仪 器 Smart Cycler ,pBluescript II SK(+) Vector,T7 Promoter,SARS Control RNA构建,绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,纯化的SARS Control RNA OD值测定结果,体外转录的SARS Control RNA 电泳照片,M1 M2,M1: -Hind digest M2: DL2,000 Marker,DNase I 处理前,DNase I 处理后,绝对定量应用例 对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量,DNA,T7 Promoter,SARS Internal Control RNA的构建,pBluescriptII SK(+) Vector,绝对定量应用例 对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量,探针的选择,绝对定量应用例 对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量,SARS Control RNA 105-101扩增曲线,SARS Genomic RNA Sample 1、扩增曲线,SARS Internal Control RNA扩增曲线,标准曲线,绝对定量应用例 对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量,定量结果,对三个样品所含SARS病毒RNA进行了准确定量。,绝对定量应用例 对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量,相对定量应用例 分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况,检测方法 SYBR Green I 荧光嵌合法 管家基因 GAPDH基因 目的基因 PAH基因 标 准 品 cDNA 试 剂 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （DRR047） SYBR Premix Ex TaqTM II (Tli RNase H Plus) （DRR820） 仪 器 Thermal Cycler Dice Real Time System （TP800）,Total RNA提取,Total RNA基因组 DNA去除,标准品RNA制备,标准曲线制作及预实验,详细的实验资料获取,实验设计及引物 设计、合成,样品Real Time PCR反应,相对定量计算及 数据分析,数据整理及论文撰写,相对定量应用例 分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况,提取Total RNA后电泳照片,提取试剂：TaKaRa RNAiso Plus （ D9108 ）,相对定量应用例 分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况,M C L B M,M：DL2,000 DNA Marker,C：Control RNA,L：Liver RNA,B：Brain RNA,目的基因标准曲线制作结果,扩增曲线图,融解曲线图,标准曲线图,管家基因标准曲线制作结果,相对定量应用例 分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况,扩增曲线图,样品目的基因定量结果,样品管家基因定量结