电子显微镜原理2015年新.ppt

1,上海水产大学生命学院 周平凡,光镜与电镜技术,2,第二部分:电子显微镜技术 （电子显微镜和电子显微术的总称）,3,一、概 述： 第一章:电子显微镜的原理和结构 第一节:几个常用的基本概念 第二节:透射电子显微镜 第三节:扫描电子显微镜 第四节:其他类型的电子显微镜,第二部分:电镜技术,4,第二章:超薄切片技术 第一节:取材 第二节:固定和固定剂 第三节:脱水 第四节:浸透和包埋 第五节:超薄切片,第二部分:电镜技术,5,第三章:电子染色技术 第一节:电子显微镜标本的正染色 第二节:电子显微镜标本的负染色 第三节:半薄切片染色,第二部分:电镜技术,6,第四章:扫描电镜生物样品制备技术 第一节:取材和标本的预处理 第二节:生物样品的干燥 第三节:生物样品的导电法,第二部分:电镜技术,7,一、概 述,8,9,透射电镜TEM（transmission electron microscope） 观察细胞内部结构 扫描电镜SEM（scanning electron microscope) 观察组织或细胞表面的立体结构,透射电子显微镜,扫描电子显微镜,电子显微镜的分类：,10,电子显微镜照片,透射电子显微镜拍摄的照片,扫描电子显微镜拍摄的照片,细胞核,红血球,11,一、概 述,12,一、概 述,13,电镜具有很高的分辨本领,能观察极微小的结构。但是电镜不能直接观察天然状态下的生物标本,必须通过各种技术将生物标本制成特殊的电镜生物样品,才能放入电镜进行观察,这些电镜样品制备技术称为电子显微术。 电镜能在生物医学领域中广泛使用,在很大程度上是由于电子显微术的改进和发展。电子显微术种类很多,这里仅介绍几种常用的技术。,一、概 述,14,通过多种电子显微术的配合-能了解生物样品的化学组成、形态结构和生理功能的关系。 电镜技术-无论在生物技术的基础研究中、还是在临床医学, 都有着广阔的发展前景。,一、概 述,15,一、电子显微镜的概况 透射电镜的点分辨率达到了2-3A,晶格分辩率已达到1A左右,已使人们能用电镜直接观察原子象； 除透射电镜外,发展了多种电镜,如扫描电镜、扫描透射电镜、分析电镜等,使我们能对样品进行综合研究。,一、概 述,16,（一）透射电镜 透射电镜-是利用电子射线穿透样品后放大而成像的一种电镜。 主要优点-分辨率高,可用来观察组织和细胞内部的超微结构以及微生物和生物大分子的全貌,在生物医学上的应用最为广泛。 加速电压-一般透射电镜（加速电压小于120KV）,高压透射电镜（加速电压在120KV与500KV之间）,超高压透射电镜（加速电压大于500KV）。,一、概 述,17,一、概 述,18,二、电镜成象的原理,19,一、概 述,20,1、一般透射电镜：就是最常用的100KV电镜。 这种电镜的分辨率高(点3A,晶格1.4A),但穿透本领小,观察样品必须很薄,如小于0.1微米的超薄切片、负染样品和复型膜等。 这种电镜在生物医学上的应用已相当普及。,一、概 述,21,3、超高压透射电镜：已有500KV、1000KV和3000KV的超高压电镜。 这种电镜具有穿透能力强、辐射损伤小、可以配备环境样品室及进行各种动态观察等优点,分辨率也已达到或超过100KV电镜的水平。 在超高压电镜上附加充气样品室,使人们有可能观察活细胞内超微结构的动态变化,对生物医学工作者很有吸引力。这种电镜庞大而且昂贵,远非一般实验室所能装备。,一、概 述,22,东京大学工学院125万伏超高压电镜（JEOLARM1250），该电镜价值1000万美元，有三层楼那么高，是世界上精确度最高的电镜之一，主要用于原子结构和物质的特性研究。,23,24,25,该电镜的开放管理时，该电镜的技术工作委员会主任市野漱告诉我们，他的电镜每天24小时向“全世界”开放。 尽管是高精度特大型电镜，他们仍然实行用户经培训合格后自行上机的开放模式。 原则上，电镜实行测试收费管理，但他们电镜开放的重点是从事高水平的测试服务与科学研究。,26,用户的样品不需要在这样高水平的电镜上测试，即便是付费，他们也不予测试，因为这等于是浪费了高水平的资源。相反，如果用户提出的样品或课题有很高的学术、科学技术价值，即便资费不够，他们也会主动接受。每年提供3的运行费用。,27,可以根据用户项目水平的高低，他们可以采用合作方式开展测试研究，甚至免费提供测试和研究。正由于他们有这样的开放与合作原则，多年来，他们的电镜在高水平研究方面发挥了重要作用，取得了许多世界一流的学术成果。,28,用户提出的样品和研究有很高的价值，他们甚至可以提供几个月的免费食宿和测试，开展合作研究。正因为如此，他们也做出了很多高水平的成果，在全世界的同行中享有很高的知名度。,29,国外实验室倡导电子显微镜室对外开放： 1、高年级学生 2、研究生 3、博士生 4、科研人员,30,31,32,UCLA纳米系统实验室,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,（二）扫描电镜 扫描电镜是利用电子射线轰击样品表面,引起二次电子等信号的发射,经检测装置接收后成像的一种电镜。 特点是景深长,所获得的图象立体感强,可用来观察生物样品的各种形貌特征。 在生物医学中,采用不同的样品制备技术可观察不同的结构,如用临界点干燥方法可观察样品的表面形貌； 用冷冻割裂方法可观察样品割裂面的结构,用铸型方法可观察管腔内表面的结构等。,一、概 述,51,一、概 述,52,1、 一般扫描电镜 目前一般商品扫描电镜采用热发射电子枪,分辩率为60A左右,若采用六棚化镧电子枪,分辨率可提高到40-50A。 这种电镜在生物医学中的应用也已相当普及。,一、概 述,53,一、概 述,54,一、概 述,55,（四）扫描透射电镜 扫描电镜中电子射线作用于样品后,其中一部分电子可透过样品成为透射电子,将透过样品的透射电子和散射电子用检测器接收成像,即成为扫描透射电镜。 这种电镜一般用场发射电子枪,兼有透射电镜、扫描电镜和分析电镜的特点,能观察较厚的样品,分辨本领和成象质量都很好,是近年来电镜技术的最大改进之一。,一、概 述,56,1、超薄切片技术 由于电子射线穿透本领很差,对厚于0.1微米的切片就很难透过。因此,必须把生物标本切得很薄才能在透射电镜下观察。 超薄切片技术就是通过固定、脱水、包埋、切片和染色等步骤,将生物标本切成薄于0.1微米超薄切片的样品制备技术,用于生物组织的内部超微结构研究。 超薄切片技术是所有电镜生物样品制备技术中最常用、最基本的一种技术。,（一）与透射电镜有关的电子显微术,57,2、负染色技术 利用电子密度比标本高的重金属盐（如磷鸽酸纳、醋酸铀等）将生物标本包围起来,增强背景散射电子的能力以提高反差,在黑暗的背景下显示标本的形态结构,称负染色技术。 这一技术操作简便,主要用于颗粒状标本（如细菌、病毒、分离细胞器等）的研究。,（一）与透射电镜有关的电子显微术,58,4、电镜细胞化学技术 利用各种细胞化学反应,在超微结构水平上研究细胞成分的分布和变化的方法称电镜细胞化学技术。 这一技术把细胞超微结构与其化学组成有机地联系起来,目前主要用于研究细胞内各种大分子物质和酶的定位等。,（一）与透射电镜有关的电子显微术,59,5、免疫电镜技术 这是一种使抗原在超微结构水平上定位的技术,应用与抗原相应的标记抗体,在电镜下观察标记物的位置,从而定位相应抗原。 这一技术有灵敏度高、特异性强的特点。,（一）与透射电镜有关的电子显微术,60,1、表面观察样品制备技术 扫描电镜适合于研究生物样品的表面特征,样品制备包括观察面暴露、固定、干燥和导电等步骤,使表面特征充分暴露而不变形。 这一技术是扫描电镜样品制备的常规技术,主要用于组织、细胞、寄生虫等表面形貌的研究。,（二）与扫描电镜有关的电子显微术,61,2、生物标本割裂技术 将生物标本放在特殊包埋剂中经冷冻或其他方法国化,然后把固化的标本割裂,暴露组织和细胞的内部结构,再经干燥和导电后在扫描电镜下观察。 这一技术使扫描电镜能观察生物标本的内部结构,目前最常用的是冷冻割裂技术。,（二）与扫描电镜有关的电子显微术,62,（一）在细胞和分子生物学方面的应用 电镜技术有力地推动了细胞生物学的发展,使许多在光学显微镜下长期不能解决的问题找到了答案。 由于电镜具有很高的分辩率,使人们对细胞结构的认识不断深入,从光学显微镜的显微结构水平提高到超微结构水平。,三、电镜技术在生物医学上的应用,63,对光镜下已经发现的细胞器如线粒体、中心体等的结构和功能,在电镜下有了新的和更深入的了解； 对光镜下争论不休的细胞器如高尔基体,在电镜下得到了证实并作了深入的研究； 在电镜下发现了很多新的细胞器和结构,如内质网、微体、微管、微丝等；电镜技术还对细胞的膜系统、细胞骨架和细胞联结的研究起着重要作用。 采用多种电子显微术相结合,使人们能够对细胞各部分的结构、代谢和功能联系起来进行动态的研究,从而极大地丰富了细胞生物学的内容。,三、电镜技术在生物医学上的应用,64,（二）在解剖学中的应用 对人体结构的认识是医学的重要基础,而这一种认识是随着技术的发展而不断深入的。 光学显微镜的出现使解剖学在大体解剖的基础上发展了显微解剖学（组织学）, 电子显微镜的出现则进一步发展了超微解剖学, 使人们对人体的认识达到了超微结构水平。,三、电镜技术在生物医学上的应用,65,（三）在微生物学中的应用 电镜技术在微生物学中的应用主要包括两个方面： 对光学显微镜下看得见的原虫、真菌、细菌等作进一步的超微结构研究； 对病毒的研究。现以病毒研究为例,说明电镜技术在微生物学中的应用。,三、电镜技术在生物医学上的应用,66,（四）在病理研究和临床诊断方面的应用 传统的病理学在疾病诊断上起着重要作用,但由于医学已发展到分子水平,原布的病理学知识已不能满足需要。近年来,随着电镜技术的发展,超微结构病理学和超微结构诊断学取得了很大的进展,有效地应用于病因研究和临床诊断上。,三、电镜技术在生物医学上的应用,67,一、透射电子显微镜原理,透射电子显微镜:简称“透镜”,68,透射电子显微镜 （transmission electron microscope TEM）,现代电子显微镜的基本形式,69,电镜与光镜主要区别,70,透射电子显微镜中，物镜、中间镜、投影镜是以积木方式成像，如果电子显微镜是三级成像，那么总的放大倍数就是各个透镜倍率的乘积。 M = M0*Mi*Mp,电磁透镜的光学性质,71,在光镜中：光束透过样品时，由于样品与光子流的相互作用产生不同程度的吸收、反射、折射和散射，其中主要是样品各部分对光的吸收特性不同而形成明暗不同的像。吸收光线少的部位，其像明亮，吸收光线多的部位，像黑暗。,电子显微镜与光学显微镜的区别,72,在电镜中：电子射线在几万伏的加速电压作用下，以极高的速度聚到样品上，高速的电子与样品中的原子发生碰撞，从而产生散射现象。 由于标本中各部分结构的厚度和密度不同，电子束受阻和产生散射情况也不同，因此透过标本的电子束就有疏密的区别，射到荧光屏上就会出现明暗不同的影像。,第二节：透射电子显微镜,73,电子束投射到样品时，可随组织构成成分的密度不同而发生相应的电子发射，如电子束投射到质量大的结构时，电子被散射的多，因此投射到荧光屏上的电子少而呈暗像， 电子照片上则呈黑色。 称电子密度高 （electron dense）。 反之，则称为电子密度 低（electron lucent）。,74,样品中各部分质量厚度的差异会引起不同的散射，当均匀的电子束穿过样品时就受到样品上信息的处理，变成一束疏密相间的电子束。散射角度较大的电子在通过物镜光栏是就被去除了。 在生物样品中细胞和组织主要由较轻的低原子序数的原子如碳、氢、氧、氮等组成，这些原子的电子散射能力很小。,电镜成象的原理,75,成像电子通过样品时，所碰到的原子数目越多，散射的可能性就越大。散射量和样品的厚度成正比。 原子核的大小和原子序数直接有关，就是和样品本身的密度有关。 原子核越大，它带的正电越多，则核周围电子云中的电子也就越多，这样散射的机率就越大。,电镜成象的原理,76,透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像， 投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。分辨率为0.10.2nm，放大倍数为几万几十万倍。 由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备更薄的超薄切片（通常为50100nm）。并用重金属盐如柠檬酸铅和醋酸铀等染色。,透射电镜原理,77,由于物体上不同部位的结构不同，它们散射电子的能力也各不相同，结果使透过样品的电子束发生疏密的差别。 在散射电子能力强的地方，透过去的电子数目就少，因而打在荧光屏上所发出的光就弱，显现为暗区； 而散射电子弱的地方，透过的电子数目多，打在荧光屏上所发出的光就强，显现为亮区。 这样便在终像上造成了有亮有暗的区域，因而出现了反差，人眼就可以辨别。,电镜成象的原理,78,由于电子的穿透力很弱，唯有在高真空条件下才可能达到一定的自由行程，故电镜镜筒必须保持高真空（10-4乇以上），样品必须很薄，一般在100KV加速电压时，样品厚度不应超过0.1微米。 电子束对人眼不能引起视觉反应，但可激发荧光物质产生荧光，故电镜的观察部份设有荧光屏。,电子束和电磁透镜,79,样品被切成菲薄的切片，质量厚度很小，电子散射能力很弱，因而反差很低，所以必须增加生物样品的相对散射能力。 在样品制备过程中要用重金属进行染色，以提高样品的散射能力。,电镜成象的原理,80,一、电子束和电磁透镜,81,透射电子显微镜具有和光学显微镜相似结构系统，不同的是： 1、用电子射线代替了照明的光线， 2、用电磁透镜代替光学显微镜的聚光镜、物镜和目镜， 3、用荧光屏代替肉眼直接观察， 4、使用了极短的电子波，能获得极高的分辨本领。 5、结构复杂。,2、透射电子显微镜的结构,82,第二节：透射电子显微镜,透射电镜内部结构,83,电子显微镜的镜筒内部要求高度真空，并且要有一整套的供电系统。,84,第二节：透射电子显微镜,真空泵管路,85,一、电子束和电磁透镜,第二节：透射电子显微镜,86,电子显微镜是利用电子射线即电子束作光源使物体成像， 要了解电子显微镜的原理，首先就要了解电子射线的特性。,一、电子束和电磁透镜,87,电子束实际上是一种阴极射线，是带负电荷的粒子，它和其它的光线一样，具有双重性: 1、具有波动性， 2、具有粒子性。,一、电子束和电磁透镜,88,1924年，De Broglie证明粒子在高速运动的时候会发射出一定波长的电磁辐射，它的波长用公式表示为： 是代表波长； h 是Planck（普郎克）常数； m 是粒子的质量； v 是粒子运动的速度。,一、电子束和电磁透镜,89,如果高速运动的粒子是电子，那么，电子在真空中运动的速度与加速电压有关，根据能量守恒定律: e是电子的电荷绝对值， V是加速电压(KV),一、电子束和电磁透镜,90,从上述式中可以算出电子的速度为: 由于电子的质量m约为质子e的1/1840，把m，v都代入公式，公式可改写成:,一、电子束和电磁透镜,91,根据上述公式： 当V= 50KV的时候，=0.053埃， 当V=100KV的时候，=0.037埃。 可见，加速电压越高， 电子束的波长越短。 现将由上式计算得出的电子束波长值列入附表：,一、电子束和电磁透镜,92,加速电压（kV）1.0 5.0 10.0 25.0 50.0 75.0 100.0 300.0 500.0 1000.0 3000.0,电子束波长() 0.387 0.173 0.122 0.077 0.053 0.044 0.037 0.022 0.017 0.012 0.007,加速电压与波长的关系,一、电子束和电磁透镜,93,电子是带负电荷的粒子，其运动方式不同于光，电子的运动主要受所处磁场和电场强度的影响，而改变其行进方向。 德国物理学家Busch早在1926年即已指出:“具有轴对称性的磁场对电子束说来起着透镜的作用”。他从理论上奠定了可利用磁场作为电子透镜的基础。,一、电子束和电磁透镜,94,什么是电磁透镜？,能使电子束聚焦的装置称为电磁透镜（electron lens）电磁透镜是一种焦距(或放大倍数)可调的会聚透镜。改变激磁电流，电磁透镜可使电子束会聚。,电磁透镜结构示意图,95,电镜的电磁透镜在线圈外包有软铁的屏蔽外壳，线圈内侧多数装有高精度加工的铁钴合金极靴，极靴的作用是使形成的高强度磁场尽可能集中在沿轴的-个很窄的范围内。 极靴的形状直接影响成象质量，所以，极靴(特别是物镜成像极靴)是电子显微镜中最重要的部件。,一、电子束和电磁透镜,96,电子在轴对称磁场作用下的行为与光学透镜一样，也服从几何光学定律，磁透镜的焦距可以用光学透镜的公式计算出。 透镜焦距和所采用的磁场强度有关，磁场越强，焦距越短，放大倍数也就越高。现代电子显微镜的成像物镜大多数采用短焦距的强磁透镜。,一、电子束和电磁透镜,97,当线圈中通以电流时，线圈周围形成磁场，从线圈中心轴某一点发出的电子，在磁场中沿螺旋线轨迹前进，然后会聚在中心轴的其它一点上。 电子束来说，磁场起着透镜的作用，有聚焦的特性，故称之为“电磁透镜”。,一、电子束和电磁透镜,98,电子束和电磁透镜的关系,99,一、电子束和电磁透镜,100,一、电子束和电磁透镜,101,在理想的情况下，电镜中的物镜、中间镜和投射镜可以利用光学中透镜成像公式，与光学的简单作图法相似：,一、电子束和电磁透镜,102,1、球面象差及畸变 2、衍射象差 3、色差 4、象散 5、景深 6、焦深 7、磁滞 8、反差与成像,电磁透镜的特性,103,二、电镜成象的原理,1-1、球面象差,104,二、电镜成象的原理,1-2、畸变,105,二、电镜成象的原理,4、象散,106,二、电镜成象的原理,5、景深,107,二、电镜成象的原理,6、焦深,108,普通光学显微镜以互不作用的光子流可见光为照明源，当光线透过样品组织结构部分时，产生不同程度的吸收、反射、折射和散射，从而形成明暗不同的组织结构影像。 吸收产生振幅差即强度差（反差），肉眼对此最为敏感，它是光学显微镜成像中最重要的因素。,二、电镜成象的原理,109,电镜是以电子束为照射源，当由热阴极发射的电子，在几十到几百万伏电压作用下，经电子聚光镜聚焦成电子束，以较高的速度投射到样品上，并和样品中的原子发生碰撞产生了一系列的现象，形成了反差。,二、电镜成象的原理,110,任何一个物体都是由原子组成的，原子则是由原子核与轨道电子(电子云)组成的。 原子与原子的间距，比原子核或电子本身的大小要长几百万倍。,二、电镜成象的原理,111,对于电子来说，物体就好象是一个实体，它在空间的分布是非常稀疏的。当电子束照射在样品上的时候，大部份电子都能从原子与原子之间的空隙中穿透过去，而只有极少一部分的电子会与原子的原子核或原子轨道电子发生碰撞。,二、电镜成象的原理,112,二、电镜成象的原理,113,如果电子是和原子核发生碰撞，电子基本上不损失能量，而只是改变运动方向，这种碰撞称为弹性碰撞，此电子发生了“弹性散射”作用。 如果电子是和轨道电子碰撞，电子不仅会改变原来运动的方向，而且还会损失一部分能量，这种碰撞称为非弹性碰撞，此电子发生了“非弹性散射”作用。,二、电镜成象的原理,114,二、电镜成象的原理,115,三、电镜的主要构成部件及性能,第二节：透射电子显微镜,116,透射式电镜主要由三大部分组成： 第一部分:电子光学系统 第二部分:真空系统 第三部分:供电系统,117,电镜的主要构成部件及性能,118,照明系统 电子枪 聚光镜 样品室 成像系统 物 镜 1、电子光学照明系统 中间镜 投影镜 观察室 观察与记录系统 照相室 自动曝光装置,（第一部分）,119,机械泵 油扩散泵 管道及自动阀门系统 冷阱，预抽室，真空干燥器 真空检测系统,（第二部分）,2、真空系统,120,交直流电源 高压电源 透镜电源 真空电源与自动控制系统 束偏转，消散器等电源及控制系统 安全系统和辅助电源,3、电子学系统,第三部分,121,JEOL JEM100CX-II透射电镜,122,123,124,125,一、电子光学系统,126,一、电子光学系统 电子光学系统即电镜的镜体，它基本上是一个电子透镜系统，一端是电子源，另一端是观查和记录系统，中间是安放样品的装置。其结构示意图见图118所示。分述如下：,127,透射电子显微镜的结构,1 阴极组件 2 阳极 3 第一聚光镜 4 第二聚光镜 5 聚光镜可动光栏 6 第二聚光镜消散器 7. 摆动器 8 样品架 9 物镜可动光栏 10物镜消散器 11物镜 12视野光栏 13第一中间镜 14第二中间镜 15投影镜 16双目显微镜 17. 快门 18观察窗 19荧光屏 20照相室 21底片暗盒,128,1照明系统 照明系统是由电子枪和聚光镜组成。其作用是为成像系统提供一个亮度高，尺寸小、高稳定的照明电于束。电子束的亮度由电子发射强度决定，束斑大小主要由聚光镜的性能决定。,129,（1）电子枪： 它是电镜的照明源，其重要性仅次于物镜。因为电镜的放大率很高，而终像的亮度是电子透过样品后亮度的1M2倍（M是电镜总放大率）。而且电镜的孔径角很小，因此，要求电子枪能产生很亮(即单位立体角的电流密度很高)的细电子束。 电子枪由灯丝阴极、栅极(或称韦氏圆筒)和加速阳极组成，参阅图1-19。,130,131,灯丝是用0.1毫米的钨丝做成V字形，通电加热至2,500-2,800K时，在尖端即产生热电子发射，形成照明束。在灯丝下方有一加速电极阳极，用来加速电子。 电压通常在50-100kV(千伏)之间。为了防止产生色差，加速电压要求高度稳定，其稳定度通常要求达到10-6/分的数量级。 在灯丝和阳极之间有一电位比阴极要负（-100-500V)的栅极。,132,栅极用于控制电子束形状和发射强度。现代电镜一般采用自给栅偏电子枪（图1-20）。把负高压接到栅板上，经过一个可变电阻(棚偏压电阻)接到灯丝上。 其优点是栅偏压电阻起负反馈作用，从而能稳定电子束流的作用；图1-20表明自偏压电子枪电子发射的示意图。由于栅极的排斥作用，使电子会聚成束。其中束交叉点处束径小于100，电子密度最高，是电镜的实际电子源。,133,134,在开始时，随着灯丝加热电流增大，灯丝温度上升，束流也增加，但由于栅偏压电阻的反馈作用，束流增长逐渐变慢，当灯温度到达某值时，束流不再随灯丝温度的上升而增大，此称为束流的饱和点。 栅偏压电阻值不同有不同的饱和点。饱和现象使束流稳定从而稳定了终像的亮度。 如果调节加热电流使之比饱和点稍小一点，此时屏上出现如图1-21的图像。,135,灯丝像，中心亮斑是灯丝尖的像，显出制造灯丝时钨丝的拉线，周围的“晕轮”是栅极帽的像。此灯丝像在电镜调整中很有用。,136,（2）聚光镜 聚光镜的作用是将来自电子枪的电子会聚到样品上，通过它来控制照明电子束斑大小，电流密度和孔径角。 照明束斑过大时，会引起样品热漂移和污染，使图像模糊不清，并会因电流密度不足而使像亮度差，故电镜多有两个聚光镜。 第一聚光镜（C1）是一个强透镜，它的作用是把有效光源的尺寸缩小，即缩小束斑直径，最小可达1-2。,137,第二聚光镜（C2）是一个弱透镜，采用长焦距的弱透镜是为了使照明孔径角足够小和在聚光镜与物镜之间提供一个较大的样品空间，以便能够放进样品台以及其它的附件。 第二聚光镜用以控制照明亮度、照明孔径角和照明斑的尺寸，但只能在第一聚光镜决定的范围内变化照明斑的大小。,138,实际操作中在像的亮度足够的条件下，第二聚光镜尽可能散焦，以获得尽可能小的孔径角（孔径角增大，球差增大）。 为了缩小照明孔径角，在第二聚光镜之下装有第二聚光镜可动光栏（100、300、400微米的圆孔)，根据需要可选取不同的光栏孔。 第二聚光镜如存在像散，亮斑成椭圆将会降低终像的亮度。第二聚光镜都装备有消散器。,139,电子枪和聚光镜（C1和C2）都装备有平移和倾斜的调整机构（机械式的或电磁式的），以进行相互之间或与物镜之间进行合轴调整。,140,2成像系统 成像系统包括样品室、物镜、中间镜和投射镜（或有两个中间镜，或有两个投射镜构成4-5个透镜系统）。 （1）样品室 第二聚光镜下面是样品室。室内有样品台，样品台支承样品并使样品可在两个相互垂直的方向移动。移动是极端精密的，在高倍放大时，重复精度应达到100A以内。多数电镜的样品台还装有使样品旋转和倾斜的装置。,141,电镜的样品载于铜网上，铜网放在样品架（或称样品筒）上。 样品架如从上向下落入物镜中，称为顶落式。顶落式由于稳定性较好，能获得较高分辨率。 样品架如从侧面插进物镜中称侧插式。侧插式样品架便于样品倾斜，旋转等，适用于分析性电镜。,142,高性能的电镜，在样品室中常装有防污染装置。电镜镜简的真空度常在10-5- 10-6乇，多是采用油扩散泵来获得高真空。由于扩散泵油和密封橡皮垫圈的真空脂的挥发，使镜筒内含有大量的碳化氢分子。这些碳化氢分子落到样品表面上形成无定形的覆盖层，它使样品的反差降低。这个覆盖层受到电子束的轰击时会分解为碳和氢。氢气进入真空中，而碳则留在样品上。这种现象称为“污染”。,143,在一些脏的镜简中，“污染”引起的碳的沉积层可达每秒5A的速度生长。“污染”层与样品一起成像显著降低分辨本领。因此，需要防污染装置。 它是一块尽可能靠近样品的冷冻金属块。通常用金属铜制成，中央有一小孔以便电子能正常通过。铜片放在样品上方或下方，或者上下方各放一块。,144,铜片连接铜棒，铜棒经过真空密封通到镜简外，浸在充满液氮的杜瓦瓶中。热量通过铜棒迅速传走，使铜片保持在-150温度。于是碳化氢分子首先凝集在冷却的铜片表面上，从而防止这些碳化氢分子去“污染”样品。,145,（2）物镜： 在样品室下面是物镜。其作用有二种：形成样品的第一级放大像和通过调节物镜线圈的激励电流，相应地改变物镜的焦距从而对像进行聚焦。 物镜是电镜的最关键部分，由它获得第一幅具有一定分辨本领的电子放大像，物镜中任何缺陷都将被成像系统其它透镜进一步放大。 电镜的分辨本领主要取决于物镜的分辨本领。,146,为了减少像差从而提高分辨本领，物镜应是强激励短焦距的。高性能电镜的物镜最短焦距约为1-2毫米，放大率约为100200倍，分辨本领约达2埃。 为了减少色差，要求激励电流高度稳定，常要求达110-6分钟。 在电镜观察中，像的漂移是一个很讨厌的现象。,147,其原因有热漂移或样品台的机械振动。热漂移是来自电子束的能量引起样品的温升和物镜激励电流产生的温升。为了减少物镜温升引起的热漂移，通常用水冷却物镜，使其保持恒温。这些冷却水管很细，并要注意冷却水的水质。 物镜中都装备有一可动光栏，它是由非磁金属如铂或钼制成，一般有3-4个大小不同的孔供选择。,148,物镜光栏除能提高像的反差外，还起控制物镜孔径角的作用：通常样品是放在物镜的前焦面附近，而物镜光栏放在物镜的后焦面附近，物镜孔径角在焦距变化不大时，近似为光栏孔半径（R）与物镜焦距（f）之比，即R/f 。 选择合适的孔径角是重要的，它对提高分辨本领和像反差有明显的影响。,149,物镜下面都装备有一物镜消散器，以最大限度减少物镜像散，以获得高的分辨本领。 （3）中间镜和投射镜。 中间镜的作用是把物镜形成的一次放大像或衍射花样投射到投射镜的物平面上，再由投射镜放大投射到萤光屏上而获得终像。中间镜是一个可变倍率的弱透镜，焦距较长，放大率在20倍之内。,150,电镜总放大倍率的改变主要利用中间镜倍率的变化来达到，电镜的总放大率为所有透镜放大率之积，即； M总=M0 M1 MP M0-物镜放大率； M1-中间镜放大率； MP-投射镜放大率。 投射镜的作用是把中间镜形成的二级放大像再放大投射到萤光屏上，从而形成终像。,151,投射镜是一个短焦距的强磁透镜。投射镜因为是作第三次放大，故对它的精度要求较低。 投射镜的像差主要表现在低放大倍数时的畸变。此时成像电子束通过透镜面积较大。一般是利用中间镜形成的“桶形畸变”和投射镜形成的“枕形畸变”互相抵消，从而获得无畸变的低放大率的像。,152,同样在成像系统中也必须备有一个重要的合轴机构。 3、像的观察和记录系统 在投射镜下面是像的观察和记录系统，终像是用萤光屏来显示。 除了用于观察的大萤光屏外，还有一个用于聚焦的小萤光屏和放大10倍的长焦距的双目光学显微镜。,153,光学显微镜由于使用很大的物镜孔径角，使用它放大时像的亮度损失很小。而使用直接增大电子光学放大倍数获得高放大倍数时，像的亮度会显著下降，这是使用光学显微镜的优点和设置它的原因。 聚焦萤光屏可以倾斜，以利通过光学显微镜进行聚焦。,154,在萤光屏下面是照相暗盒，它和电磁快门、曝光表组成像的记录系统，用于把终像拍摄记录下来。 把终像拍摄下来不但能把像长期保留以便研究分析，而且由于照相底片的分辨本领大大高于萤光屏，因此，拍摄出来的底片往往含有在萤光屏直接观察中看不到的细节。,155,在拍摄使用曝光表要注意：曝光表所反映的像的亮度必须能代表整个像的平均亮度，否则所拍摄得的像不能获得满意的结果。 多数的电镜中，照相室和观察室之问都装备有单独的气阀，使照相室可单独徘气和放气，以便更换底片时不会破坏整个镜简的真空，并且可继续进行像的观察。,156,2、真空系统,157,真空系统和电子学系统都是为了保证电子光学系统正常工作的辅助系统。 1、真空系统 真空是指完全没有任何物质的空间，也就是说这个空间内的气压为零的。这样的空间称为“绝对真空”。 通常我们所讲的真空是指它里面的气压少于常压的空间。,158,一个空间的真空程度与它的气压是密切相关。 气压越接近常压大气压的空间的真空度就越低，反之气压越低，则真空度就越高。 真空度用气压表示。 一个大气压=760毫米水银柱的压力。 国际上用“乇” （Torr