饲料中氨基酸的测定.ppt

饲料中氨基酸的测定,黎观红 江西农业大学动物科技学院,氨基酸是组成蛋白质的基本结构单位，也是蛋白质的分解产物； 蛋白质营养氨基酸营养（不是很确切，小肽营养）； 理想蛋白或理想氨基酸模式（畜禽日粮的氨基酸平衡理论） 饲料蛋白质营养价值评定。,6.1 概述,6 饲料中氨基酸的测定,氨基酸的分析测定,饲料级氨基酸添加剂 （单体制剂含量或纯度测定）,简单的化学分析,6 饲料中氨基酸的测定,6.2 氨基酸饲料添加剂质量标准与检验,饲料中氨基酸的测定(教材P120-131),6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换层析法） 氨基酸自动分析仪：主要由日本（Hitachi日立系列产品）、美国（贝克曼（Beckman）公司）、英国（安玛西亚公司）、德国（安米诺西斯公司）等国家生产。 氨基酸测定专用仪器，准确度高，设备昂贵。,日立L8800氨基酸自动分析仪,L-8900氨基酸自动分析仪的内部结构,饲料中氨基酸的测定,6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换树脂法） （一）测定原理,饲料中氨基酸的测定,6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换树脂法） （一）测定原理 氨基酸的分离（离子交换树脂分离）： A、离子交换层析（ Ion Exchange Chromatography ）基本原理 以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同进行分离纯化的层析方式。,饲料中氨基酸的测定,A、离子交换层析基本原理,离子交换剂由基质、电荷基团（或称功能基团） 和 反离子组成。基质一般是不溶性聚合物，如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等；,纤维素O CH2 COO- Na 基质 电荷基团 反离子,树脂 N+(CH3) OH-,RA+B RBA+(RA是阳离子交换剂，B为溶液中的离子或待分离的生物分子）,A、离子交换层析基本原理,当A+=B+,RBRA, 说明 R 与B的结 合力比A大；反之亦然。 对于两性蛋白而言，结合力取决于其等电点以及 溶液的pH值。,饲料中氨基酸的测定,1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合。 2.吸附阶段：样品与反离子进行交换。 3、4. 解吸附阶段：用梯度缓冲液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质。 5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，即可重复使用。,饲料中氨基酸的测定,A、离子交换层析基本原理,Ion-exchange chromatography,（一）测定原理 B、氨基酸的分离（离子交换树脂分离） 氨基酸：两性电解质，不同氨基酸电离常数各不相同。pH、pI,氨基酸的pI从2.77（天门冬氨酸）到10.76（精氨酸）不等。大多在56之间。谷氨酸：3.22；组氨酸：7.59；赖氨酸：9.74。氨基酸的等电点 不同氨基酸对树脂的亲和力不同，其强弱顺序为：碱性氨基酸芳香族氨基酸中性氨基酸酸性氨基酸及羟基氨基酸。,6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换树脂法）,阴离子 两性离子 阳离子 （pHpI） （pH=pI） （pHpI）,氨基酸pH2.2 的条件下都带正电荷，在阳离子交换树脂上均 在被吸附，但结合强度各不相同。 随着缓冲液在离子交换柱上流动，氨基酸不断地吸附、解吸附，由于氨基酸性质的差异（酸碱性、极性、分子大小） 吸附强度有差异。 不同氨基酸与离子交换树脂的亲和力不同： 碱性氨基酸 芳香族氨基酸中性氨基酸酸性氨基酸及羟基氨基酸。 提高流动相pH值，氨基酸正电荷减少，吸附力减弱，最后从离子交换柱上洗脱下来。 洗脱顺序是酸性和带羟基氨基酸、中性氨基酸、碱性氨基酸。 氨基酸标准液中各种氨基酸在氨基酸自动分析仪上被洗脱的顺 序一定，标准液各种氨基酸的浓度一定，洗脱峰的面积一定，由此可计算出样品中各种氨基酸的含量。,（一）测定原理 B、氨基酸的洗脱,饲料中氨基酸的测定,6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换树脂法） （一）测定原理 B、氨基酸的洗脱,用pH递增的柠檬酸盐缓冲溶液洗脱侧链pKa增大的氨基酸,分离后的氨基酸与茚三酮试剂在高温反应器中进行衍生反应，生成可以被分光光度计检测的有色物质，然后在检测器中被检测出来。,C、氨基酸与茚三酮反应,茚三酮反应,饲料中氨基酸的测定,6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换树脂法） （一）蛋白质的水解 A、盐酸水解（常规或直接水解法） 适用范围：饲料原料、配合饲料、浓缩饲料中除色氨酸、含硫氨基酸以外的15种氨基酸的准确测定。（为什么是15种？） 样品加入6 mol/L的HCl溶液，真空封口，在110下水解2224 h，冷却后定容、过滤、蒸干。上机测定。,此过程中，色氨酸全部被破坏，含硫氨基酸被部分氧化损失，大约损失2030。加入巯基乙醇可部分保护蛋氨酸，提高测值1020,天冬酰胺,谷氨酰胺,饲料中氨基酸的测定,6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换树脂法） （一）蛋白质的水解 B、氧化酸水解 氧化水解法是将饲料蛋白中的含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸等)用过甲酸氧化，然后进行酸解生成磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，再经离子交换色谱分离、测定。 本方法主要适用于含硫氨基酸（胱氨酸和蛋氨酸）的准确分析测定。此方法还可以测定芳香族氨基酸（酪氨酸和苯丙氨酸）及组氨酸以外的氨基酸。 水解中色氨酸破坏，不能测定。 酪氨酸在以偏重亚硫酸钠做氧化终止剂时，被氧化，不能测准。 酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸则在以氢溴酸作终止剂时被氧化，不能测准。,饲料中氨基酸的测定,6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换树脂法） （一）蛋白质的水解 C、碱水解 本方法适用于饲料原料、配合饲料和浓缩饲料中色氨酸的测定。 饲料蛋白在110，碱的作用下水解，水解出的色氨酸可用离子交换色谱或高效反相色谱分离、测定。 另： 分光光度法测定饲料中的色氨酸：饲料中蛋白质经碱水解后，降解成多肽和游离的氨基酸，在酸性介质中，氧化剂存在下，色氨酸吲哚环与对二甲氨基苯甲醛反应生成蓝色化合物，在一定范围内颜色深浅与色氨酸含量成正比。,饲料中氨基酸的测定,6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换树脂法） （一）蛋白质的水解 D、酸提取法 酸提取法适于配合饲料、预混料