木瓜蛋白酶水解制备乳酪蛋白肤工艺条件的研究.pdf

浙江 农业学报A ct a A 梦 icl 山 urae Zheji a 哪ns 行 20( 2): 1 23一 1 26， 2 仪 粥 木瓜蛋白酶水解制备乳酪蛋白肤工艺条件的研究 陈新峰 ， 王君虹 ， 洪狄俊“ ， 周利亘 ， ( 浙江省农业科学院食品加工研究所， 浙江 杭州31(X)2 1 ; 2 杭州市农业科学院， 浙江杭州3 1 (X 刀 4 ) 摘要: 研究了木瓜蛋白 酶水解制备乳酪蛋白肤的工艺条件。通过正交试验， 确定其最优工艺条件为: 底物 浓度4 . 0 %， 酶比 底物值【 公510 . 巧， 声 6 . 0 ， 酶解时间4 h ， 酶解温度55， 其水解度达到42. 9%。 关键词: 乳酪蛋白; 木瓜蛋白 酶; 水解度 中图分类号: 联 刀 3文献标识码: A文章编号: 1 侧 又一 巧 24( 2 仪 8 ) 泥一 0 1 23一 以 T ech n 0 l o gyc o n d i t i o nsofp re P a ri ng 。 跳 犯 i n by 勿由o l y s i s ofP a P a i n c 现N x in 衣 n g l ， w A N G J un h o 嗯 ， ， H O N G 任 j UnZ， 川o u h 一 罗 n ， ， 苦 ( 力 钻 . uteof声 议 过乃 次 划 动 召 ， 肠和嗯月 c 初 助 理of 彻位1山 毋 Z Ho够而u A 凶 山 叮 of奄成政王叮 以 碑 p 山 n;ds g 班 犯 ofh y d rn 1 y s is(D H ) 牛乳不仅含有丰富全面的营养成分， 而且还 是生物活 性肤的 重要来源 。 这些活性肤具有 重要的生理功能， 在保健食品以及医药品的研究 开发中具有很高的潜在价值， 因此， 制备和鉴定 乳酪蛋白中的活性肤已成为各国学者研究的热 门课题。 乳酪蛋白肤是乳酪蛋白经酶水解得到的小 分子多肤， 它比游离氨基酸更易、 更快被机体吸 收利用， 并且具有多种特殊的生理活性功能: 抗 菌、 降血压、 降胆固醇、 免疫调节、 延缓衰老、 促进 矿物质吸收 卜 7 等。 这些功能片段在蛋白质大 分子中尚不具备独特的生理活性功能， 只有在特 定的蛋白酶水解过程中活性肤片断才会从蛋白 质大分子中释放出来， 一旦这些活性肤片断被释 放， 就具有了 特殊的 生理活性功能8J。 本试验利用木瓜蛋白酶酶解法制备乳酪蛋白 肤， 为乳酪蛋白的进一步开发利用提供科学依据。 收稿 日期二 2 (X 】 7 一n一 21 基金项目: 浙江省科技计划项目( 2 11 又 已入 狡 8 ) 作者简介: 陈新峰( 19 80一) ， 男， 浙江富阳人， 主要从事生物活性 物质提取、 农产品深加工等研究工作。 E- 二1 ， h 曰 拼 infe飞1 9 即 5 叮旧 ， 沈 叮 n ，通讯作者， 周利亘， E-n 】 : 伍 司 3 3 331 63. ， 1 材料与方法 1 . 1 试验材料 乳酪蛋白( 青海凯兴干酪素有限公司) ; 85 万可9 菠萝蛋白酶、 10万以9 动物蛋白水解酶 ( 广西南宁庞博生物技术有限公司) ; 7 万叮9 木 瓜蛋白 酶、 2 朋万记9 中性 蛋白 酶( 上海宝丰生化 有限 公司) ; 1 20万可9 胃 蛋白 酶、 250 万了9 胰蛋 白酶( 国药集团化学试剂有限公司) ; 氢氧化钠、 盐 酸、 T C A 、 浓硫酸( 杭州华东医药器材化剂分公司) 。 1 . 2 试验仪器 万方数据 1 24浙江农业学报第 加卷( 2 0 0 8 ) 53356123 42373817 50505 44332 nn ，4 进侧跳关 8642 3333 B S Z ooS 一 W E I 电子天平( 北京塞多利斯仪器 有限公司) ; H . H . 5 21. 4 电热恒温水浴锅( 江苏 常熟医疗器械厂) ; A 丑 k e TDL 50B 离心机( 上海安 亭科学仪器厂) ; p H 计等。 1 . 3 试验方法 1 . 3 . 1 乳酪蛋 白肤制备方法 取4 %乳酪蛋白溶液， 在 85 的恒温条件 下加热预处理 巧而n ， 冷却至室温后， 加人蛋白 酶， 在55 恒温条件下酶解 s h ， 然后迅速升温 至1 00 灭酶5 而n ， 冷却至室温后， 在4 呱j r/ min 离心分离除去未酶解的乳酪蛋白， 上清液即 为乳酪蛋白肤。 1 . 3 . 2 可 溶性氮的测定( 微量扩散法户 取乳酪蛋白 肤溶液5 而， 加人1 9 消化催化 剂和 10时浓硫酸， 消化至黄绿色， 取出冷却至 室温， 加水定容。然后取sd加人到扩散皿外 室， 并在扩散皿内室加人2而2 %硼酸溶液， 再 向外室加人4 而40%浓N aOH溶液， 并迅速盖上 玻片。在室温条件下放置 24 h 后， 用标准的盐 酸溶液滴定硼酸溶液至紫罗兰色。 含氮量N ( %) =( VZ一v l ) xNH x o . o l 4 x 稀释倍数/ 样品重量 xl oo% v ， 一空白 所需标准酸体积( 而) ; 巧 一滴定 待测液所需标准酸体积( 时) ; 服一标准酸溶液 当 量浓度; 0 . 0 14二 1 耐当 量氮的克数。 1 . 3 . 3 水解度的测定一TCA法 0 10耐酶解物中加入 10耐TCA ， 在水浴中加 热20 而n ， 然后在4仪 心r/而n 离心 巧而n 。取上 清液， 蛋白 质总氮和上清液可溶性氮由1 . 3 . 1 节 中方法计算。 水解度( n H ) =( N 3 一N l ) / ( 从 一万 1 ) NI一空白 试样的 含氮量; 凡一乳酪蛋白的 含氮量; 凡一T C A 处理后酶解液的 含氮量。 1 . 3 . 4 蛋白酶筛选试验方法 在蛋白酶供应商提供的适宜酶解条件下， 对 乳酪蛋白进行酶解， 各酶重复3 次， 取平均值， 水 解度由 1 . 3 . 3 节方法测定。 白酶、 中性蛋白酶、 胃蛋白酶和胰蛋白酶， 分别在 适宜的酶解条件下， 对乳酪蛋白进行酶解， 然后 测定水解度( 表 1 ) 。由表 1 可见: 木瓜蛋白酶酶 解乳酪蛋白的水解度明显大于其它蛋白酶， 其水 解度42. 53%， 表明采用木瓜蛋白酶对乳酪蛋白 进行酶解。 表 1 不同蛋白酶的水解度比较 T a b le 1 Com 钾ri son ofD Hofd iffe比 n t p n 成 e ase 蛋白酶 木瓜蛋白酶 动物蛋白酶水解酶 菠萝蛋白酶 中性蛋白酶 胃蛋白酶 胰蛋白酶 水解度/ % 9 . 77 1 1 . 49 2 . 2 木瓜蛋白酶的单因素试验 2 . 2 . 1 底物浓度时水解度的影响 在总酶量4 %， p H 7 ， 温度55条件下， 对不 同浓度的底物， 分别酶解sh ， 然后测定其水解度 ( 图1 ) 。当总酶量一定的情况下， 水解度先随着 底物浓度的增加而升高; 当底物浓度达到4 % 后， 水解度随着底物浓度的增加而降低。因此， 底物浓度选用4 . 0 %较为适宜。 2 . 2 . 2 酶比底物值比( E / 5)对水解度的影响 在底物浓度4 %， 声 7 ， 温度55条件下， 选 20406 ， 08 . 01 0 . 0 底物浓度/ % 2 结果与讨论 2 . 1 蛋白酶的筛选 选用木瓜蛋白酶、 动物蛋白水解酶、 菠萝蛋 3 0 Les - 一 一 一 - - - - J - - - - - - 一 0. 1 00 . f 5O2 0O 一 2 50. 3 0 E j S 图 1 底物浓度和砂5 对蛋白酶水解度的影响 F i g . I E ffec tsofs u 加 t r a t econce 川 m t i o l舀朋d可Son D H of场如l y 阳】 case in 万方数据 陈新峰等: 木瓜蛋白酶水解制备乳酪蛋白肤工艺条件的研究 1 2 5 05 54 O5 43 承、侧胜关 用不同的酶比底物值( Fs)， 酶解s h ， 然后测定 其水解度( 图 1 ) 。水解度随着酶比底物值的增 大而升高， 当酶比底物值0 . 15时， 水解度增加极 其缓慢。因此， 酶比 底物值选用0 . 巧较为适宜。 2 . 2 . 3 p H对水解度的影响 在底物浓度 4 %， 酶比底物值 0 . 巧， 温度 55条件下， 选用不同的州值， 分别酶解s h ， 然 后测定其水解度( 图2 ) 。溶液的酸碱度对木瓜 蛋白酶的酶活性影响较大， 酸性过强或碱性过强 都会抑制木瓜蛋白 酶的活性。当溶液p H值在 中性或偏弱酸性条件， 木瓜蛋白酶酶解乳酪蛋白 有较高的 水解度。因 此， 选用p H7 较为适宜。 2 . 2 . 4 酶解时间对水解度的影响 在底物浓度4 %， 酶比 底物值0 . 巧， p H7 ， 温 度为55条件下， 选用不同的时间对乳酪蛋白 进行酶解， 然后测定其水解度( 图2 ) 。木瓜蛋白 酶酶解乳酪蛋白的水解度随着时间增加而升高; 当酶解时间超过 3h 以后水解度的增加趋于平 缓， 因此， 酶解时间选用 3h 较为适宜。 3 0 L ee ee we ee eees es es es L es 一 - - - 4 55 05 56 06 5 温度1 图3 温度对蛋白酶水解度的影响 F 啥， 3 D 升 c t oft e m pem t on D Hof场面l y 鱿 刁c asem 2 . 乡 木瓜蛋白酶酶解乳酪蛋白制备乳酪蛋白肤 的正交试验 根据单因素试验结果分析， 酶解的温度对水 解度影响最小， 因此， 正交试验以底物浓度、 酶比 底 物 值、 p H 和 酶 解 时 间 为 试 验 因 素 ， 设 计场 ( 罗 ) 正交试验表， 对木瓜蛋白酶酶解乳酪蛋白工艺进 行优化研究( 表3 ， 表4 ) 。 从表4 中可以看出: 底物浓度对木瓜蛋白酶 酶解乳酪蛋白 水解度影响达到极显著， 酶比底物 崔 琢 寸 木瓜蛋白酶酶解乳酪蛋白水解度影响达到 表2 场 罗 ) 正交 试验的因素水平设计 T a h le Z 氏s ignof场( 34 ) 。 汕090耐 ex peri ment 水平 7 P H 值 因素 底物浓酶比 底p H ( C)酶解 度( A ) / %物值( B )时问( D ) /h 200 1 06 . 02. 0 4 . 00 . 1 57 . 03 . 0 6 . 00 . 21)8 . 04， 0 曰声JU曰 1卜月lres卜IL卜卜ee.L3尸es.J- 050505005 433221154 岁、侧盛关 表3 正交试验结果 T a b le3 叭 l e 璐d 肠ofo rd l o 邵 Inal test 05 43 831644510732487165 对四27373940303734 23456 醉解时间lh 图2 州 值和酶解时间 对蛋白 酶水解度的影响 Rg . Z E 压 己 c isof州 a n d 幻 m e on D Hof场枷l y 淡 沮c asem 试验号水解度 ABCD/ % 2 . 2 . 5 酶解温度对水解度的影响 在底物浓度4 %， 酶比 底物值0 . 巧， p H7 的 条件下， 控制不同酶解温度， 酶解 sh ， 然后测定 其水解度( 图3 ) 。木瓜蛋白酶酶解乳酪蛋白的 水解度随着温度的上升而提高， 当温度超过 60， 部分木瓜蛋白酶失活， 水解度降低。从图 中曲线可以看出， 55与印时的水解度， 几乎 相等， 因此， 酶解温度选用 55较为适宜。 30 . 94 3 5 3 1 34 . 1 4 4. 3 7 34 . 26 3 3 . 7 7 3 2 . 3 3 1 . 93 32 85 3 3 . 3 2 34 . 22 13 7 T = 30 1 1 7 14972883 27383411 123456789kl朽朽R 万方数据 1 2 6浙江农业学报第20卷( 2 ” 8 ) 表4 D H 值方差分析 1 抽 加 e 4 V 面ance翻 司 y s i s ofD Hvalu es 方差来源 A B C D 总和 偏差平方和 2 1 3 3 l 6 自由度F值 71 . 峨 】 1 0。 3 3 2 . 00 凡 FO.侣 ( 2 ， 4) 二6 . 94 FOo ， ( 2 ， 4 ) =1 8 . 0 显著性 芳釜 22，28 3 25 3 3 . 0 1 . 5 显著。从表3 的极差分析中可以得出， 各因素对 木瓜蛋白酶酶解乳酪蛋白水解度影响的主次顺 序是: 底物浓度 酶比 底物值 p H 酶解时间; 其最佳工艺条件为: 凡残 C l 巧， 即底物浓度 4 . 0 %， 酶比底物值0 . 巧， p H6 . 0 ， 酶解时间4 . 0 h 。 采用最佳工艺条件( 凡珑 c l 巧) 对乳酪蛋白 进 行酶解验证， 其水解度大于正交表中任一组合， 且水解度为42. 9 %。 的稳定性， 延长酶的使用期和保管期， 能与反应 物和产物分开， 有效地控制生产过程， 并能在生 产中反复连续使用。 参考文献: 3 小结 本研究确定了木瓜蛋白酶酶解法制取乳酪 蛋白肤的工艺; 通过正交试验， 确定其最佳工艺 条 件为: 底物浓度4 . 0 %， 酶比底物值0 . 巧 ， 州 6 . 0 ， 温度55， 酶解4 . o h ， 其水解度达到42. 9 %。 水解度可间接反映肤得率大小。试验研究 表明: 采用木瓜蛋白酶酶解乳酪蛋白可以得到较 高的水解度， 即乳酪肤得率相对较高。若要实现 工业化生产， 就必须考虑乳酪蛋白和蛋白酶的高 效利用问题。例如乳酪蛋白的循环利用如 何进一步利用未被酶解的乳酪蛋白; 应用酶的固 定化技术， 保持酶的催化活性， 提高酶分子结构 【 1 李全阳， 夏文水， 张国农. 牛乳酪蛋白源生物活性肤制备及 结构研究现状 J. 中国乳品工业， 2 以