基因pf40在玉米中的遗传转化.pdf

中国农业科学 2009,42(9): 3334-3338 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2009.09.041 收稿日期：2008-11-28；接受日期：2009-03-30 作者简介：李 博（1980） ，男，山西临汾人，硕士，研究方向为植物基因工程。TelE-mail：libolb3104 。通信作者朱 登云（1962） ，男，浙江金华人，副教授，博士，研究方向为植物基因工程及遗传育种。TelE-mail：zhudy 基因pf40在玉米中的遗传转化 李 博，于静娟，赵 倩，朱登云，敖光明 （中国农业大学生物学院/农业生物技术国家重点实验室，北京 100193） 摘要： 【目的】基因pf40来源于谷子未成熟种子 cDNA 文库，它或其同源基因普遍存在于禾本科植物中。初 步研究显示pf40具有促进分蘖（枝）的功能。本文旨在研究玉米的分蘖特性是否与pf40功能相关。 【方法】以玉 米自交系 Z3、Z31 与 Q31 杂交组合的胚性愈伤组织为转化受体，用基因枪轰击法将pf40超表达载体（PF40HS）和 抑制表达载体（PF40R）导入玉米。然后观察pf40超表达和抑制表达两种不同表达类型的转基因玉米分蘖表型。 【结果】经潮霉素筛选和 PCR 检测，共获得 53 株 T0代转基因玉米。通过对 T1、T2代转基因玉米的 PCR 检测以及 Southern 和 tRNA dot blot 分析表明，外源pf40已整合到玉米基因组中并得到表达，而且能稳定地遗传给下一 代；通过对转pf40玉米茎基部的分蘖表型的观察发现，无论是转超表达载体还是抑制表达载体的转基因植株与未 转基因植株均无明显差异。 【结论】单独调控玉米中的pf40或其同源基因并不能改变玉米的分蘖表型特征，玉米 中的pf40或其同源基因的确切功能，尚待进一步研究。 关键词：pf40；玉米；转基因植株；分蘖（枝） Transformation of the Gene pf40 in Maize LI Bo, YU Jing-juan, ZHAO Qian, ZHU Deng-yun, AO Guang-ming (State Key Laboratory for Agrobiotechnology, College of Biology, China Agricultural University, Beijing 100193) Abstract: 【Objective】 Isolated from the cDNA library of millet immature seed, the gene pf40 (or its homolog ) is ubiquitously distributed in cereals crop genome. Preliminary studies indicate that the gene pf40 plays a role in promoting tillering (branching). This study aimed to clarify whether the function of gene pf40 (or its homolog) is related to the tillering in maize. 【Method】 Two plant expression vectors with sense and knock-out (RNAi) gene pf40 promoted by 35S promoter were introduced into the embryogenic callus of maize hybrids(Z3, Z31, Q31) through particle bombardment. Regenerated plants were verified to be transgenic by PCR amplification, Southern blot and tRNA dot blot. The observation about the phenotype of the tillers on the base of the transgenic plants stems could determine the effect of the gene pf40 on the tillers. 【Result】 After the hygromycin B selection and PCR screening, 53 transgenic plants were obtained. According to the results of PCR test, Southern blot and tRNA dot blot on T1 and T2 generation, the foreign gene pf40 had been integrated into the maize genome, also it could express and pass generation to generation. After investigated into the phenotypes of both the tiller nodes on the base of stems, unfortunately, no distinct difference was observed between the transgenic plants and the untransgenic plants. 【Conclusion】 The phenotype of the maize without tillers will not be changed by merely altering the expression of the gene pf40 or its homolog. And the exact functions of the gene pf40 or its homolog in maize need further to be investigated. Key words: pf40; maize; transgenic plants; tillering (branching) 0 引言 【研究意义】分蘖是禾本科作物如谷子、水稻、 小麦等的重要特性之一，由分蘖芽在一定条件下发育 而成。同属禾本科的玉米（Zea mays L.）尽管也存在 与水稻、小麦等同样的分蘖节，但经过几千年的人工 驯化，这些分蘖芽在正常情况下处在休眠状态，不产 生分蘖。 基因 pf40 是从谷子未成熟种子的 cDNA 表达 9 期 李 博等：基因 pf40 在玉米中的遗传转化 3335 文库中筛选得到， 并在禾谷类作物中普遍存在的基因。 但在不同禾谷类作物中 pf40 的拷贝数略有不同， 在玉 米中则可能是多拷贝的1-2。在谷子、烟草、拟南芥中 的转基因研究揭示，pf40 具有促进分蘖（枝），削弱 顶端优势的功能1-2。 那么玉米在禾本科作物中显得如 此与众不同的分蘖特性是否与 pf40 的功能有关呢？ 【前人研究进展】分枝（蘖）是植物茎对多变的环境 适应性的一种表现，它经历腋生分生组织的形成、腋 芽的形成及腋芽的生长三个发育阶段。分枝相关突变 体的发现和进一步研究为探索高等植物分枝发育的分 子机理提供了线索：番茄中的 Ls3、Bl4，金鱼草中 的 CUP5，玉米中的 ba16，拟南芥中的 CUC1-37、 LAS8、REV9、LAX10，水稻 MOC111等基因在腋生 分生组织的形成阶段发挥作用；拟南芥中的 MAX12、 BUD113，豌豆中的 RMS14，玉米中的 tb115，水稻中 的 OsTB116等基因则在腋芽的生长阶段发挥功能；而 在腋芽形成阶段， 由于缺乏特异的突变体， 研究较少， 目前发现拟南芥 STM6，CUC 等基因可能与这一阶段 相关。另外，还有一些基因如拟南芥中的 Sps 可能在 上述几个时期都发挥作用17。 此外， MKK13与多胺18 也参与了植物分枝的调控。【本研究切入点】为何玉 米同其它禾谷类作物之间会出现如此巨大的分蘖表型 差异？这种表型差异的遗传机制是否与pf40或其同源 基因有关？正是基于上述的疑问，笔者进行了玉米的 pf40 的转化研究。【拟解决的关键问题】通过转基因 方法，超量或抑制玉米中的 pf40 表达，看可否改变玉 米的分蘖特性。 1 材料与方法 1.1 植物材料的准备与培养 用于基因枪转化的玉米胚性愈伤组织来自自交系 （inbred lines）Z31、Z3 与 Q31 杂交幼胚。愈伤组织 诱导及培养方法见参考文献19。 1.2 质粒和质粒 DNA 的提取 用于转化的 pf40 超表达载体（PF40HS）和抑制 表达载体（PF40R）分别由中国农业大学生物学院农 业生物技术国家重点实验室构建。两种质粒分别含有 CaMV35s 启动子驱动下的正向完整的 pf40 和正反重 复的回文结构的 pf40，它们均以潮霉素磷酸转移酶基 因（Hpt）为筛选标记，如图 1 所示。 按常规方法培养大肠杆菌（E. coli）后，采用碱 性裂解法提取质粒 DNA（参见分子克隆 ） 。 1.3 基因枪转化及抗性愈伤组织的筛选和植株再生 图 1 PF40HS 和 PF40R 的基本结构 Fig. 1 The construction of PF40HS and PF40R 基因枪转化、抗性愈伤组织筛选、植株再生和移 栽等方法见参考文献19。 1.4 基因组 DNA 的 PCR 检测 剪取 35 cm2的玉米幼嫩叶片组织，应用 SDS 法19小量快速提取玉米叶片的基因组 DNA。 根据 35S 启动子序列设计引物： 35Sp1（21nt）：5-CTTACGCAGCAGGTCTCAT CA-3； 35Sp2 （23nt） ： 5-CCACCTTCCTTTTCCACTATC TT-3。 PCR 反应条件：在 95预变性 5 min；95，变 性 1 min；55，退火 1 min；72，延伸 1 min；扩 增循环数：30；最后 72，延伸 10 min。扩增产物用 0.8%琼脂糖凝胶电泳 EB 染色观察。扩增产物大小为 532 bp。 1.5 植株基因组 DNA Southern 杂交 CTAB 法19或 SDS 法19提取 PCR 检测呈阳性植 株叶片基因组 DNA。将 20 g 左右 DNA 的限制性酶 （通常为 Hind）酶切产物电泳后，通过毛细作用转 移到尼龙膜上。以 35S 启动子引物扩增质粒 PF40HS 的回收产物标记探针，进行杂交。 1.6 转基因植株的总 RNA 点杂交 用苯酚/氯仿抽提 Southern 杂交阳性的转基因植 株的叶片总 RNA。取 510 g 总 RNA 热变性 5 min 后直接点样于尼龙膜上，以潮霉素磷酸转移酶基因 （Hpt） 的引物对扩增片段回收产物标记探针， 进行杂 交。 22nt Hpt 引物序列： Hpt1：5-GGCGAAGAATCTCGTGCTTT CA-3； Hpt2：5-CAGGACATTGTTGGAGCCGA AA-3。 2 结果与分析 2.1 T0、T1和 T2代再生植株的 PCR 检测 由于玉米中存在 pf40 或其同源基因， 本试验中用 35S 启动子引物分别对 PF40HS 和 PF40R 转化的 T0 3336 中 国 农 业 科 学 42 卷 代、T1代、T2代再生植株进行 PCR 检测，若能扩增 出 532 bp 的特异条带，则为 PCR 阳性植株，部分扩 增结果如图 2 所示。在 64 株 T0代转 PF40HS 植株中 有 25 株是 PCR 阳性植株；在 41 株 T0代转 PF40R 再 生植株中，有 28 株是 PCR 阳性植株。在 T1和 T2代 转基因植株中，目的基因出现了分离。并在 T2代植株 中筛选得到11个纯合的株系， 其中正义载体9个株系， 干扰载体 2 个株系。 M：标准分子量；1：阳性对照；2：负对照（无菌水）；3-8：T0代玉 米再生植株 M: 1kb ladder; 1: Positive control; 2: Water as control; 3-8: T0 Regenerated maize plants 图 2 部分 T0代再生植株的 35S 启动子 PCR 检测结果 Fig. 2 CaMV 35S promoter PCR analysis of some T0 regenerated maize plants 2.2 T2代转基因植株的基因组 Southern 杂交检测 对所有 PCR 检测为阳性的 T2代植株首先进行点 杂交分析，然后再进行 Southern 杂交检测（图 3）。 在点杂交为阳性的 15 植株中，有 10 株是 Southern 杂 交为阳性植株，其中 4 株为转超表达载体（PF40HS） 植株，分属于 4 个不同的株系；6 株为转抑制表达载 1：正对照（探针）；2：未转基因植株；其它：T2代转基因再生植株 1: Positive control (probe fragment); 2: Non-transformed plants; The others: T2 regenerated maize plants 图 3 部分 T2代植株基因组 DNA Southern 杂交结果 Fig. 3 Genomic DNA Southern blot analysis of some T2 regenerated maize plants 体（PF40R）植株，分属于 4 个不同的株系。 Southern 杂交结果表明，目的基因已整合到玉米 基因组中，并能稳定遗传到下一代。 2.3 T2代转基因植株的总 RNA 点杂交检测 为检测转基因植株的外源 pf40 是否表达，对 Southern 点杂检测为阳性的 T2代转基因植株进行 RNA 点杂交分析（图 4） 。杂交结果表明，外源 pf40 在转基因植株中有不同程度的表达。在被检测的 15 个植株中，8 株有杂交信号，其中 3 株为转超表达载 体（PF40HS）植株，分属于 3 个不同的株系，5 株为 转抑制表达载体（PF40R）植株，分属于 4 个不同的 株系。 A1：正对照（探针）；B1：未转基因植株；其它：T2代转基因再生植 株 A1: Positive control (probe fragment); B1: Non-transformed plants; The others: T2 regenerated maize plants 图 4 T2代植株的总 RNA 点杂交结果 Fig. 4 Total RNA dot blot analysis of some T2 regenerated maize plants 2.4 转基因植株的表型观察 取Southern 和Northern 杂交皆为阳性的T2代转 基因玉米， 用于分蘖表型观察以及 pf40 在玉米中的功 能分析。结果显示，无论是转超表达载体还是转抑制 表达载体的玉米植株起分蘖表型均与未转基因的对照 玉米无明显的差异 （图 5） 。 玉米中的 pf40 或其同源基 因的确切功能，尚待进一步研究。 3 讨论 分蘖是一个数量性状，受多基因控制，分蘖表型 的产生是由主效基因、 修饰基因等的相互作用的结果。 虽然玉米具有产生分蘖的潜力， 但在正常生产条件下， 玉米分蘖芽处于休眠状态，说明玉米存在着抑制分蘖 的遗传机制。玉米中的基因 tb115和 tga120在玉米分 蘖的形态建中起重要的作用，tb1 的突变导致玉米分 蘖15。进一步研究还发现，tb1 表达的强弱也将影响 9 期 李 博等：基因 pf40 在玉米中的遗传转化 3337 箭头所指为腋芽产生的部位 The arrows show the locations of axillary buds 图 5 转pf40 玉米与非转基因玉米的分蘖部位表型对比 Fig. 5 The comparison of the tiller between the transgenic and non-transformed plant 分蘖的发生15。 冯晓燕等1将 pf40 转入烟草， 发现其有促进分枝、 削弱顶端优势的功能。 而且在拟南芥中 pf40 也有类似 的作用21。刘颖慧等2报道：超表达 pf40 的转基因谷 子分蘖数比未转基因的对照植株增加 23 个，抑制 pf40 表达的转基因谷子分蘖数比未转基因的对照植株 减少 12 个。随后，栾云霞在对水稻，徐摇光在对小 麦的 pf40 异源转化中，也得到了类似的结果（私人通 讯） 。这些研究结果都表明，pf40 具有促进分蘖（枝） ， 削弱顶端优势的功能。但在笔者的研究中，在转 pf40 的转基因玉米中， 无论是促进 pf40 表达还是抑制其表 达均未发现对玉米分蘖产生影响。 4 结论 单独调控玉米中的pf40或其同源基因的表达并不 能改变玉米分蘖表型， 玉米中的 pf40 或其同源基因的 确切功能及其与玉米分蘖表型的关系，尚待进一步研 究。 References 1 冯晓燕. 谷子中与顶端优势相关基因 PF40 的克隆及功能研究D. 北京: 中国农业大学, 2001. 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