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第27卷 第2期作 物 学 报Vol . 27, No. 2 2001年3月ACTA A GRONOM ICA SI N ICAM ar. , 2001 利用清蛋白多态性鉴定玉米种子纯度研究 陈景堂 池书敏 刘志增 孟义江 宋占权 (河北农业大学,河北保定, 071001) 提 要 利用改进的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对生产上应用的53个玉米杂交种及亲本自交系干种 子清蛋白(白蛋白A lbum in)进行了电泳分析。结果表明,改进的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分辨率高、 鉴别能力强、准确;不仅能鉴别杂交种及亲本自交系,对血缘关系较近的材料,如同母异父单交种、含 有同一血缘的不同衍生系也能区分开。利用该技术对6个杂交种10份样品的种子纯度进行了检验,同 时利用田间种植鉴定法进行了测定,二者相关达极显著水平(r= 0. 9007),说明改进的聚丙烯酰胺凝胶 电泳技术用于玉米种子纯度检验是可靠的。 关键词 玉米;清蛋白;聚丙烯酰胺凝胶电泳;种子纯度 Studies onPurityIdentif icationof MaizeSeedwith Album in Polymorphism CHEN Jing2Tang CH I Shu2M in L I U Zhi2Zeng M EN G Yi2Jiang SON G Zhan2Q uan (A g ricultural U niversity of H ebei,B aod ing, 071001,China) Abstract I mproved PA GE technique w as a high resolving and identifying pow er, nice repeat capacity asw ell as quick and accurate identification method.In this experi ment, maize seed album in of 53 hybrids and parental inbred lines w ere analyzed w ith the electrophoretic technique. The results show ed that the PA GE technique can distinguish not only the seeds of hybrid and parental inbred line but also those of the single2cross hybrids w ith one same parent.Field test show ed the consistent result to the electrophoretic analysis of seed purity from 10 samples in 6 hybrids. Two results from the two methodsw as significantly related in statistics(r= 0. 9007). Key words M aize; A lbum in; PA GE(polyacrylam ide gel electrophoresis); Seed purity 利用生化指纹鉴定技术进行玉米品种鉴定和纯度检验国内外都有研究,如玉米醇溶蛋白 等电聚焦电泳(Zein2IEF) 13; 同工酶电泳4 6; 玉米蛋白PA GE法7;玉米种子白蛋白和球 蛋白乳酸聚丙烯酰胺凝胶电泳等8;利用RFL P、RA PD等分子标记技术进行玉米种子纯度 鉴定也有报道9, 10。上述方法有的成本高,有的试验条件要求严格,有的操作技术复杂,因 而难以在生产上应用。研究一种适当的方法用于玉米种子纯度检验是非常必要的。本研究旨 在通过清蛋白电泳分析,为玉米种子的纯度鉴定提供一种准确、可靠、经济、快速的检验方 法。 本研究得到河北省农业厅资助(冀农科9716) 收稿日期: 1999210227,接受日期: 2000204229 Received on: 1999210227, Accepted on: 2000204229 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 1 材料与方法 1. 1 材料 选用32个玉米自交系及用它们组配的21个杂交种作为试验材料(表 1) 。 表1 试验材料 Table 1 Materials tested 自交系 Inbred line 杂交种 Hybrid 冀815冀35冀538112鲁原92冀单31冀单29太合1 Ji815 Ji35 Ji53 8112Luyuan92Jidan31Jidan29Taihe1 丹3404788151552106掖107掖单12掖单13掖单19 Dan340478 8151552106Ye107Yedan12Yedan13Yedan19 502京404黄野4获唐黄5003西玉3京单931唐抗5 502Jing404Huangye4Huotanghuang5003Xiyu3Jingdan931Tangkang5 黄早4Mo17选34八苏E28京黄417植抗4石9221 Huangzao4Mo17 Xuan34Basu E28Jinghuang417 Zhikang4Shi9221 京779038488H21综31掖单22农大60沈单7 Jing779038 488H21Zong31Yedan22Nongda60Shendan7 79028双7413189郑228531掖单5掖单9掖单15 79028Shuang7413189Zheng228531Yedan5Yedan9Yedan15 P53 BS110 掖单4掖单52鲁玉10 P53 BS110 Yedan4Yedan52 Luyu10 1. 2 田间试验 采用人工套袋授粉的方法进行严格的选择提纯,并组配杂交组合。按农 作物种子检验规程的田间种植方法进行纯度测定。 1. 3 样品提取 利用手工单粒磨粉器粉碎干种子,移入1. 0 mL离心管,加提取液(15% 蔗糖+ 0. 01%甲基绿 )600 L, 室温提取0. 5 h, 10000 r?m in离心10 m in,上清液用于电泳。 1. 4 电泳 采用乳酸2乳酸纳缓冲系统,分离胶浓度13. 8% ,交联度3. 8%;浓缩胶浓度 4. 9% ,交联度30%。取上清18L加样,室温下稳压式电泳,固定染色(0. 01%考马斯亮蓝 R250+ 10%三氯乙酸 )5 m in 以上,拍照或制干胶。 2 结果与分析 2. 1 改进的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的鉴别能力 2. 1. 1 杂交种间和自交系间电泳谱带比较 利用改进的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对组配 的15个杂交种及30个自交系进行了电泳比较(图1、 2) 。结果表明,改进的聚丙烯酰胺凝胶 电泳技术分离的清蛋白谱带多、分辨率高,每个玉米材料都有自己独特的清蛋白谱带,自交 系间、杂交种间、自交系与杂交种间都有明显差别,通过电泳图谱能够彼此区别。说明玉米 种子清蛋白具有丰富多态性,足以用来区别所有供试杂交种和自交系。 2. 1. 2 亲缘关系较近材料的电泳谱带差异 图3是以8112为公共母本、以丹340、冀53、 双741、52106、81515、黄早4、双105、H21作父本的8个同母异父杂交种太合1、反交冀单 29、掖单5、掖单9、掖单15、掖单4、掖单52、鲁玉10的电泳图;图4是含有旅大红骨同一 血缘的不同自交系选34、E28、丹340、502、郑22的电泳图。以上两图表明,虽然各材料之 间的亲缘关系较近,但都能彼此区别,每一材料都有各自独特的清蛋白 “指纹” 。 7912期 陈景堂等:利用清蛋白多态性鉴定玉米种子纯度研究 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 图1 不同杂交种电泳图 Fig. 1 Electrophoretic band of different maize hybrids 1.石9221; 2.京单931; 3.植抗4; 4.唐抗5; 5.京黄417; 6.冀单31; 7.掖单12; 8.掖单13; 9.掖单19; 10.西玉3; 11.掖单22; 12.冀单29; 13.太合1; 14.农大60; 15.沈单7; 1. Shi9221; 2. Jingdan931; 3. Zhikang4; 4. Tangkang5; 5. Jinghuang417; 6. Jidan31; 7. Yedan12; 8. Yedan13; 9.Yedan19; 10. Xiyu3; 11.Yedan22; 12. Jidan29; 13. Taihel; 14. Nongda60; 15.Shendan7 2. 1. 3 F1杂交种人为混入亲本自交系或其 它杂交种的电泳鉴别 为验证改进的聚 丙烯酰胺凝胶电泳技术检验结果的准确性, 由他人配制杂交种及亲本自交系、其它杂交 种的未知混合样,用改进的聚丙烯酰胺凝胶 电泳技术进行鉴别,以核实未知样品的组成 及比例。图5是他人在冀单29中混入母本 冀53和父本8112的电泳检测结果。根据冀 单29有来自母本冀53的Rf值为0. 31和来 自父本8112的Rf值为0. 33的谱带,而冀 53只有Rf0. 31带而无0. 33带, 8112只有 Rf0. 33带而无0. 31带。通过电泳图可清楚 地鉴别出参试的17粒样品中有3粒是8112 种子(第4、7、8样)和1粒冀53种子(第3 样)。图6是在反交冀单29中混入8112和 其它杂交种的电泳结果,不难看出参试的 17粒种子中有1粒8112(第17样)和两粒其 他杂交种(第3、5样)。以上两组试验结果 得到混样人的证实。试验结果表明,改进的 聚丙烯酰胺凝胶电泳技术能够准确鉴别F1 杂交种子中混有的异种子。 图2 不同自交系电泳图 Fig. 2 Electrophoretic band of different maize inbred 1.冀815; 2.冀35; 3.冀53; 4.8112; 5.丹340; 6.478; 7.81515; 8.52106; 9.502; 10.京404; 11.黄早4; 12. Mo17; 13.黄野4; 14.获唐黄; 15. H21; 16.掖107; 17.3189; 18.京7; 19.79038; 20. P53; 21. BS110; 22.综31; 23.5003; 24. E28; 25.选34; 26.八苏; 27.鲁原92; 28.79028; 29.488; 30.双741; 1. Ji815; 2. Ji35; 3. Ji53; 4.8112; 5. Dan340; 6.478; 7.81515; 8.52106; 9.502; 10. Jing404; 11. Huangzao4; 12. Mo17; 13. Huangye4; 14. Huotanghuang; 15. H21; 16. Ye107; 17.3189; 18. Jing7; 19.79038; 20. P53; 21. BS110; 22. Zong31; 23.5003; 24. E28; 25. Xuan34; 26. Basu; 27. Luyuan92; 28.79028; 29.488; 30.Shuang741; 891 作 物 学 报 27卷 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 图3 以8112为母本的8 个同母异父杂交种电泳图 Fig. 3 Electrophoretic band of 8 single2cross hybrids used 8112 as female parent 1.太合一; 2.反交冀单29; 3.掖单5; 4.掖单9; 5.掖单15; 6.掖单4; 7.掖单52; 8.鲁玉10; 1. Taihe1; 2. Reciprocal cross jidan29; 3. Yedan5; 4. Yedan9; 5. Yedan15; 6. Yedan4; 7. Yedan52; 8. Luyu10 2. 2 田间种植鉴定与改进的聚丙烯酰胺凝胶电泳测定结果的比较 田间种植鉴定目前仍是鉴定玉米种子纯度的权威方法。为验 证改进的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检验结果的可靠性,试验对6 个杂交种10份样品,分别用改进的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术和田 间种植鉴定法进行纯度测定。电泳测定110粒, 2次重复,取平均 值,结果见表2。对电泳结果(x)与田间种植鉴定结果(y)进行了回 归分析,y= 8. 3784+ 0. 9537x,相关系数r= 0. 9007,达极显著水 平。表明改进的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术能较准确测定玉米种子 纯度。根据回归方程,在测定电泳纯度的情况下,可推算出田间纯 度。 3 讨论 3. 1 从本质上讲,品种鉴定就是基因型鉴定。蛋白质是结构基因 表达的初级产物,可以看作是结构基因的标记,分析品种间关系, 就要分析鉴定那些有多种分子形式的蛋白质,如果蛋白质有足够 的多态性,分析方法又能够检测这种多态性,那么鉴定蛋白质的多 态性也就了解了作物品种的遗传组成,从而也就是鉴定了品种。改 进的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离的蛋白质谱带有30条左右,多 者可达40条,而且分辨率高。通过电泳图谱的分析发现,所供试 的53个玉米材料均具有其特异的清蛋白谱带。在检测F1杂交种中 图4 含旅大红骨血 缘不同自交系电泳图 Fig. 4 Electrophoretic band of different maize inbred lines w ith Luda2 honggu consanguinity 1.选34; 2. E28; 3.丹340; 4.502; 5.郑22; 1. Xuan34; 2. E28; 3. Dan340; 4.502; 5. Zheng22 混有亲本自交系或其他异品种种子时,其准确性基本达到百分之百,田 间验证试验证明了改进的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术在检验玉米种子纯 度方面是可靠的。 3. 2 改进的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术具有以下特点:(1)快速。清蛋 白提取只需3045m in,电泳只需4550m in,染色2030m in。从样 品准备到电泳结束,总共只需22. 5 h。如果利用双夹芯25个点样孔 的电泳槽,两人半天可测100粒种子。(2)经济。改进的聚丙烯酰胺凝 胶电泳使用的化学试剂均为常用试剂,大部分是国产,购买方便。普通 国产电泳设备,就能收到较好的电泳效果。初步估算,每鉴定一个样品 纯度 (400 粒计)只需人民币30元左右,是海南岛种植鉴定的1? 20( 海南 岛种植鉴定400粒种子约耗资600元人民币)。(3)重复性和稳定性较 好。多次重复试验表明,各品种的谱带类型重复性良好,基本不受来 源、贮存年限和灌浆后收获早晚的影响。这种稳定性为种子生产的田间 检测提供了有利的工具。在种子收获前直接对杂种生产田的母本植株上 的杂交种子进行电泳鉴定,既方便快捷,又准确可靠。(4)操作简单。 清蛋白是水溶性蛋白质,其提取相对简单;清蛋白电泳不需要同工酶电 泳那样严格的试验条件,也没有Zein2IEF和分子标记技术复杂的操作, 在我国绝大部分种子公司现有的条件下都可应用。可望解决我国长期没 有解决的玉米种子快速、准确的检验问题。 9912期 陈景堂等:利用清蛋白多态性鉴定玉米种子纯度研究 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 图5 冀单29杂交种混入母本冀53和 父本8112的电泳图 Fig. 5 Electrophoretic band of single hybrids Jidan 29 m ixed female parent Ji 53 and male parent 8112 seeds 图6 反交冀单29杂交种混入其它 杂交种和亲本8112的电泳图 Fig. 6 Electrophoretic band of reciprocal cross Jidan 29 m ixed other hybrids and parent 8112 seeds 表2 种子纯度测定结果 Table 2 The results of seed purity 材料 M aterial 电泳测定纯度(% ) Purity under electrophoresis test 田间鉴定纯度(% ) Purity under field test 西玉3(1)91. 396. 1 Xiyu3(2) 92. 698. 7 掖单12(1)84. 288. 9 Yedan12(2)91. 8 95. 3 掖单1987. 889. 8 Yedan19 掖单1393. 298. 2 Yedan13 京黄417(1)87. 692. 0 Jinghuang417(2)92. 8 96. 3 鲁原单14(1)90. 296. 2 Luyuandan14(2)94. 7 96. 5 3. 3 试验结果表明,田间种植鉴定 纯度值普遍高于电泳检验纯度值(表 2) 。由于后者是对种子进行直接测 定,能反映种子的真实纯度;而前者 是对种子长成的幼苗和成株进行形态 鉴定,由于杂交种中混有的自交种子 容易发生不发芽、不出苗或出苗后中 途死亡等情况,故使得纯度结果偏 高。此外还有周期长、费用高等缺 点,越来越不能满足市场经济发展的 需要,而