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169 生物工程食品科学2011, Vol. 32, No. 13 内切壳聚糖酶在食品级壳寡糖酶法 生产中的应用 杨 萍，徐贤柱，游清徽，赵喜华，王曼莹* (江西师范大学生命科学学院，江西 南昌 330022) 摘 要：研究1 株曲霉 JXSD- 01 发酵液中内切壳聚糖酶(eCSN)的纯化与功能，以寻求一种清洁的生产不含单糖的 壳寡糖的方法。经分析，不含外切酶活性的 eCSN 蛋白酶比活力 50U/mg，分子质量为25kD，酶的最适温度为 63，最适 pH6.5。经 N 末端测序，内切壳聚糖酶的 N 端序列为 YNLPNNLKQ。eCSN 用于天然大分子壳聚糖 的生物降解，可获得分子质量在 10003500D 的寡糖聚合物，其中无单糖污染，达到国际食品级壳寡糖质量 标 准 。 关键词：曲霉发酵液；内切壳聚糖酶；壳聚糖；壳寡糖 Application of Endo- chitosanase in Enzymatic Preparation of Food- grade Oligo- chitosan YANG Ping，XU Xian- zhu，YOU Qing- hui，ZHAO Xi- hua，WANG Man- ying* (College of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China) Abstract ：In order to obtain a novel and clean preparation process for food- grade oligo- chitosan without monosaccharide, an endo- chitosanase (eCSN) that can degrade chitosan was purified from fermentation broth of Aspergillus JXSD- 01 and its properties were also explored. The specific activity of the eCSN was above 50 U/mg, and its molecular mass was approximately 25 kD. The optimal reaction temperature and pH of the enzyme were 63 and 6.5, respectively. The sequence of N- terminal in the enzyme was YNLPNNLKQ. The eCSN could used for the degradation of chitosan as a natural large molecule to produce oligosaccharides with molecular weights in the range of 10003500 D. The obtained oligosaccharides did not contain monosaccharides and could reach the international quality standard for food- grade oligo- chitosan. Key words：fermentation broth of Aspergillus；endo- chitosanase (eCSN)；chitosan；oligo- chitosan 中图分类号：Q814.9 文献标识码：A 文章编号：1002- 6630(2011)13- 0169- 04 收稿日期：2010- 09- 21 基金项目：科技部创新基金资助项目(07c26213600571；08c26213600923l) 作者简介：杨萍(1977 )，女，助教，硕士，研究方向为食品生物技术。E- mail：yefeng77 * 通信作者：王曼莹(1944 )，女，教授，博士，研究方向为食品生物技术。E- mail：wangmy8888 壳聚糖(chitosan)发现于 19 世纪，大量的研究证明 壳聚糖是一种安全、有效的功能性食品，国外在 20 世 纪已将壳聚糖以及用于生物降解的壳聚糖蛋白酶列入了 食品与食品添加剂范围，韩国于 1995 年批准为食品添 加剂1，日本于 1996 年批准为食品添加剂2。由于其 溶解性的问题，严重阻碍了壳聚糖资源有效应用与高 值 化 。 壳聚糖作为研制终端产品的天然生物原料，无论是 分子质量大小还是溶解性能都远远不能满足其需要3。 长期以来，人们采用强酸或过氧化氢等化学方法达到 水溶的目的，因其降解产品中存在大量的不明衍生物 而限制了食用。此外，采用化学降解或非专一性复合 酶降解壳聚糖的工艺也无法获得分散度低的、分子质 量可控的水溶性壳聚糖中间体或壳寡糖4- 7。因此，研 制无外切酶活性的专一性内切壳聚糖酶( e n d o - chitosanase，eCSN)应用于食品工业，成为了该领域 研究的聚焦点，吸引了各国众多研究机构与研究人员的 注意与兴趣8- 10。 本实验室从淤泥中筛选获得一株较为理想的生产胞 外分泌型内切壳聚糖酶的曲霉菌株JXSD- 01，从菌株发 酵液中分离纯化获得较高活性的、专一性内切壳聚糖 酶。经分析，这一内切壳聚糖酶属 GH- 75 类。用此酶 降解脱乙酰度大于 85% 的壳聚糖，获得不含单糖的壳寡 糖混合物。 2011, Vol. 32, No. 13食品科学生物工程170 1材料与方法 1.1菌株 曲霉 JXSD- 01 菌株 实验室自行筛选。 1.2材料与试剂 壳聚糖 德兴市银海生化实业有限公司。 N- 乙酰氨基葡萄糖、壳聚糖氨基葡萄糖盐酸盐 美 国 Fluka 公司；BCA 蛋白质定量检测试剂、蛋白质标准 Marker 上海生工生物工程技术服务有限公司；丙烯酰 胺甲叉双丙烯酰胺、Tris、SDS、N,N,N,N-四甲基二 乙胺(TEMED) 意大利BBI公司；SP- Sepharose FF 美 国 Phaemacia 公司。 1.3仪器与设备 UV- 3802紫外分光光度计、 UV- 2100分光光度计 尤 尼柯(上海)仪器有限公司；DYY- 12 电脑三恒多用电泳 仪、DYCZ- 24DN 迷你双垂直电泳槽 北京六一仪器厂； SORVALL Biofuge Stratos 全能台式高速冷冻离心机 德 国 Kendro公司；GSHA- 100 不锈钢反应釜 威海鑫泰化 工机械有限公司；SR 系列高速离心喷雾干燥器 无锡 市东宇胜机械制造有限公司；476 型蛋白质/ 多肽测序仪 PE 公司。 1.4方法 1.4.1内切壳聚糖酶的纯化 曲霉 JXSD- 01 发酵培养液11(30L 罐，三级发酵) 离心除菌，收集上清液(粗酶液)；上清液通过膜滤或 排阻分离去除小分子杂质，然后用乙醇沉淀，收集 富集目标物质的沉淀物( 此即粗酶)；粗酶沉淀物经 SP- Sepharose FF 离子交换柱层析分离纯化12，平衡液 PBS(pH7.0，0.02mol/L)，梯度洗脱液含0.51.5g/100mL NaCl的磷酸缓冲液，流速1.5mL/min，每管收集1.5mL。 分别在0.720.85g/100mL NaCl与1.031.18g/100mL NaCl 处获两个蛋白吸收峰。其中，含1.031.18g/100mL NaCl 的磷酸缓冲液洗脱峰含内切壳聚糖酶蛋白。 1.4.2内切壳聚糖酶理化性质检测 酶蛋白纯度与分子质量检测：采用 SDS- 聚丙烯酰 胺凝胶电泳13，蛋白质标准Marker14.4116.0kD。 酶蛋白浓度测定：采用 BCA 法。 酶蛋白活力检测：采用改进的 Uchida 法。1 个酶 活力单位定义为每分钟产生相当于1mol 还原糖所需酶 量，单位为 U 。 酶蛋白序列测定：采用蛋白质 / 多肽测序仪进行 N 末端测序。 1.4.3内切壳聚糖酶的生物学特性与动力学分析 酶蛋白水解专一性分析：分别以几丁质、脱乙酰 度 85% 壳聚糖、脱乙酰度 95% 以上壳聚糖为底物， 进行酶解反应，分析酶解反应情况与酶解反应速度。 酶蛋白水解模式分析：以脱乙酰度95% 以上壳聚 糖为底物，进行酶解反应，薄层层析检测壳寡糖混合 物的单糖成分14- 16。 酶蛋白动力学分析：分别进行 eCSN 的最适温度、 最适 p H 值、激动剂、抑制剂测定。 1.4.4食品级壳寡糖的酶法生产 壳聚糖原料质量要求：脱乙酰度 85%；工业级 内切壳聚糖酶冻干品质量要求：酶比活力 50U/mg， 纯度达到单一蛋白电泳纯。 酶法生产食品级壳寡糖的工艺按参考文献16进行。 2结果与分析 2.1内切壳聚糖酶的纯化结果 纯化步骤 总酶活总蛋白质酶比活力/回收纯化 力 /U量 /mg(U/mg)率/%倍数 粗酶液86745.61.901001.00 膜滤65933.95.6576.02.97 乙醇沉淀54925.421.663.311.40 SP- Sepharose FF2855.1155.833.129.40 表 1 内切壳聚糖酶的纯化结果 Table 1 Summary of purification procedures of eCSN 内切壳聚糖酶是一种胞外酶，故纯化过程相对简 单，发酵产物经超滤除去菌丝体得到粗酶液。从表 1 可知，粗酶液的酶比活力相对较低，只有 1.9U/mg， 说明初酶液中除了含有酶之外还含有大量的杂质，故 单位质量的蛋白质体现出来的酶活性不高；粗酶液通 过膜滤除去部分大分子物质，经过此步骤酶的比活力 为 5.65U/mg，说明经此步骤去除了部分杂质而酶蛋白 被大量截留下来，故酶比活力有了一定的提高，即单 位质量的蛋白质体现出来酶活性有所提高；再用乙醇 将发酵液中的蛋白质沉淀下来得到粗酶，经此步骤 后，酶比活力提高到 21.6U/mg，增加了 10.4 倍。说 明经过此步骤发酵液中非蛋白质成分被大量去除，而 酶蛋白与其中的一些蛋白质杂质被沉淀下来，故酶的 纯度获得很大的提高。但是此物质是蛋白质混合物， 还含有外切酶等蛋白质杂质，故再将此产物进行亲和 层析处理，经亲和层析后酶比活力为 55.8U/mg，增加 了 28.40 倍。经过此步骤，粗酶中的包括外切壳聚糖 酶在内的蛋白质杂质被大量的去除，可以说经过此部 骤后，产物中主要是酶蛋白，即纯度得到极大的提 高。故可知亲和层析的效果是最佳的，经后续实验可 知经 SP- Sepharose FF 层析纯化后的产物中只含有内切 壳聚糖酶。 171 生物工程食品科学2011, Vol. 32, No. 13 将各级纯化产物进行SDS- PAGE 电泳，结果如图 1 所示，发酵液(泳道 5)中蛋白条带较多，发酵液经膜过 滤后除去了大部分的大分子(泳道 6)，分子质量为35kD 以上的蛋白质大大减少，此步骤取得了很好的纯化效 果。获得的产物再经亲和层析进行分离，通过使用不 同浓度的缓冲液进行洗脱，除去了其中的杂质蛋白，其 中泳道 4 就是前期洗脱蛋白，其中可以看到，大多数的 杂蛋白都被洗掉了，最后使用合适的缓冲液进行洗脱， 如图泳道1 和泳道2 所示，只有一条分子质量为25kD 左 右的目标条带，即通过亲和层析，最终获得了纯度很高 的目标蛋白即可用于生产的专一性极强的内切壳聚糖酶。 2.3内切壳聚糖酶最适反应条件与酶动力学分析 在内切壳聚糖酶的最适 pH 值与最适温度条件下， 采用改进的Uchida 法测定内切壳聚糖酶活性。由图 2 可 知，酶的活性随 pH 值的增大有继续增长的趋势，但是 由于在pH6.0 以上底物壳聚糖会成为絮凝状，酶活无法 测量，故测定最适 pH 值为 6.0。由图 3 可知，该酶的 最适反应温度为 60。 金属离子相对酶活力/%金属离子相对酶活力/% Zn2+91Ba2+103 Ca2+97Hg2+1.6 Mg2+95Fe3+21 Mn2+197Ag+17 Cd2+28Pb2+43 表 2 金属离子对内切壳聚糖酶酶活性的影响 Table 2 Effect of metal ions on eCSN activity 从表 2 可以看出，Mn2+对内切壳聚糖酶有强烈的 激活作用，而 Hg2+、Ag+、Cd2+、Pb+对其则有强烈 抑制作用。 2.4内切壳聚糖酶 N 末端测序结果 内切壳聚糖酶纯品经蛋白质/ 多肽测序仪进行N 末 端测序，氨基酸残基分别为：YNLPNNLKQ。N 端氨 基酸序列的测定，为该酶基因的进一步克隆表达做好了 准备。经与 GenBank 中发布的相关蛋白序列进行比对， 发现跟其中发布的壳聚糖酶序列有很高的相似性。 2.5内切壳聚糖酶eCSN 水解产物分析结果 壳聚糖经内切壳聚糖酶降解后的产物经薄层层析分 析结果如图 4 所示，2 泳道内切壳聚聚糖酶水解产物中 不含氨基葡萄糖单糖，壳寡糖含量达到 95% 以上。 2.6食品级壳寡糖的酶法生产中底物质量浓度的选择 由图 5 可知，在内切壳聚糖酶酶促降解过程中，底 物浓度对反应速率影响较明显，底物质量浓度为3g/100mL时 最 佳 。 1、2. 1.031.18g/100mL NaCl 洗脱液；3. 蛋白质Marker；4. 0.72 0.85g/100mL NaCl 洗脱液；5、6. 发酵液、目标物富集后的粗酶液。 图 1 各级纯化产物 SDS- PAGE图 Fig.1 SDS- PAGE of target products at different purification stages 116.0kD 123456 66.2kD 45.0kD 35.0kD 25.0kD 18.4kD 14.4kD 图 2 内切壳聚糖酶最适 pH 值的确定 Fig.2 Optimal pH for eCSN activity 酶比活力/(U/mg) pH 80 60 40 20 0 3.03.54.04.55.05.56.0 图 3 内切壳聚糖酶最适温度的确定 Fig.3 Optimal temperature for eCSN activity 酶比活力/(U/mg) 温度/ 80 60 40 20 0 2030405060708090 2.2内切壳聚糖酶纯度与分子质量检测结果 1糖 123 2糖 3糖 4糖 5糖 1.氨基葡萄糖单糖标准品；2.内切壳聚糖酶酶 解产物；3.聚合度 15 的氨基葡萄糖标准品。 图 4 内切壳聚糖酶酶解产物薄层层析结果 Fig.4 Thin layer chromatogram of eCSN hydrolysate of chitosan 2011, Vol. 32, No. 13食品科学生物工程172 由图 6 可知，按照壳寡糖 / 壳低聚体专一性壳聚糖 酶法生产工艺获得的产品经飞行质谱分析，表明产品中 没有单糖，所测样品为分子质量 10003500D 的聚合 物，基本重复单位分子质量为 161D，在质谱图上显示 出系列相差 161D 的质谱峰。 3结 论 本研究对曲酶来源的一种内切壳聚糖酶的理化性质 与生物学特性进行了分析，重点研究了内切壳聚糖酶的 酶解作用特点。表明只要控制酶量与反应时间，内切 壳聚糖酶降解壳聚糖后可以得到的聚合度为210 的壳 寡糖混合物，其还原端含有GlcNAc 或者GlcN 基团，非 还原端含有GlcNAc 或者GlcN 基团，产物中不含单糖。 从实验结果分析，本研究室获得的内切壳聚糖酶切断壳 聚糖的糖苷键模式以为 GlcN- GlcN 糖苷键为主，也可以 切断GlcNAc- GlcN或GlcN- GlcNAc类型的糖苷键。因此， 内切壳聚糖酶是一种生产壳寡糖的专一性壳聚糖内切 酶，属壳聚糖酶家族的 GH- 75 类群。这一曲霉菌株发 酵液中的内切壳聚糖酶是应用于食品级壳寡糖清洁生产 的理想的生物催化剂。 参 考 文 献 ： 1Korea Food & Drug Administration. Korea Food Additives CodeS. Korea, 1996. 2Korea Food & Drug Administration. Under the Food Sanitation ActS. Korea, 2008. 3YOSHIHARA K, HOSOKAWA J, KUBO T, et al. Purification and properties of a chitosanase from Pseudomonas sp. H- 14J. Biosci Biotech Biochem, 1992, 56(6): 972- 973. 4OMUMASABA C A, YOSHIDA N, SEKIGUCHI Y, et al. Purification and some properties of a novel chitosanase from Bacillus subtilis KH1 J. Appl Microbiol, 1999, 46(1): 162- 271. 5SOMASHERKAR D, JOSEPH R. Chitosanases: properties and applications: a reviewJ. Bioresource Technology, 1996, 55(1): 35- 45. 6YAMASAKI Y, HAYASHI I, OHTA Y, et al. Purification and mode of action of chitosanolytic enzyme from Enterobacter sp.G- 1J. Biosci Biotechnol Biochem, 1993, 57: 444- 449. 7SHIMOSAKA M, NOGAWA M, OHINO Y. Chitosanase from the plant pathogenic fungus Fusarium solanif sp. phaseoli: purification and some propertiesJ. Biosci Biotechnol Biochem, 1993, 57: 231- 235. 8LIU Jing, XIA Wenshui. 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