课件：金黄色葡萄球菌1.ppt

1,研究背景,1,2,试验内容,3,4,研究目的和意义,全文结论,汇报内容,2, 畜禽粪便微生物污染及其处理,畜禽粪便中含有大量的病原菌和寄生虫卵，如大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蛔虫卵和球虫卵等，如不及时处理，会成为危险的传染来源，造成疫病传播。此外，大量的畜禽粪便若处理不当则会孳生蚊蝇，使环境中的病原菌和寄生虫蔓延，使病原菌种类增多，菌量增大，甚至造成人、畜传染病传播。 粪便处理方法：饲料化处理、能源化处理、肥料化处理。,研究背景,3,寄生于人和动物皮肤粘膜鼻腔胃肠道等处，无鞭毛不形成芽孢和荚膜的革兰氏阳性葡萄球菌,金葡菌对人畜均产生多种危害，诸如各种化脓性疾病、败血症或脓毒败血症、乳房炎等,经呼吸道、消化道、交配、昆虫叮咬、挤奶工的手或挤奶机械等途径引起哺乳动物的感染,金葡菌概念,金葡菌传播,金葡菌危害, 金黄色葡萄球菌及其危害,4, 石灰氮及其作用,石灰氮俗称乌肥或黑肥，主要成分为氰氨化钙, 另有氧化钙和碳素等成分。黑灰色油性颗粒或粉状物，微溶于水，显碱性，易吸潮水解。是一种无残留无污染能消毒灭菌提高氮肥利用率改良土壤和抑制农作物病虫害为害的多功能肥料。,5,研究目的和意义,研究奶牛粪便致病性金葡菌的分离鉴定和草药敏感性,并在堆肥中添加石灰氮对杀灭金葡萄菌的效果及堆肥发酵的影响。,为消除畜产公害、防治畜产污染、防止致病性金葡菌的发生、蔓延、防疫以及粪便的有效处理和利用提供科学的依据。,6,石灰氮对堆肥发酵的影响,试验内容,石灰氮对金葡 菌的杀灭效果,金葡菌分离鉴定及体外抑菌,试验一 奶牛粪便致病性金黄色葡萄球菌的分离鉴定及体外抑菌,方法,7, 致病菌的鉴定:,镜检,生化试验,动物试验, 致病菌的纯培养,PCR鉴定, 体外抑菌：,茜草、乳香、牛蒡子、青蒿、姜黄、大黄、丹参、枸杞等8种草药 采用牛津杯法,材料,内蒙古呼伦贝尔市牧业4旗不同奶牛户散养牛群中，随 机选择的206头奶牛的直肠粪便。,8,图1 金葡菌在甘露醇氯化钠培养基上生长情况, 分离细菌培养特性及形态学特性,图2 金葡菌革兰氏染色,结果,从206份牛粪样中共分离出34株金黄色葡萄球菌。,9,表2 34株分离菌株生化试验结果,注：“+”表示分离菌生化反应呈阳性；“-”表示分离菌生化反应呈阴性。, 生化试验结果, 动物致病性试验结果,10,34株分离菌中有7株均在2448h内致死小白鼠，而阴性对照组的小白鼠全部健活,14d后剖检未见有病变。致死小白鼠在死前均可见昏睡、厌食、被毛蓬松、精神萎靡、四肢僵硬直至死亡。经剖检可见肠粘膜充血,有臭味的黏性黄绿色渗出物,肾脾肿大。脾脏和腹腔积液接种于高盐甘露醇陪养基上时均生长出金黄色中等大小的圆形菌落。革兰氏染色镜检为革兰氏阳性，并呈现中等大小的葡萄串状球菌。, PCR试验结果,图3 金黄色葡萄球菌的PCR鉴定,M 为DNA marker； 14 为分离菌株 PCR产物； 5 为无菌水对照； 6 为标准菌株；,扩增引物为Coa基因，是致病性金葡菌特有的基因，目的片段为800bp。, 体外抑菌结果,表3 8种中草药对7株致病性金黄色葡萄球菌的平均抑菌结果 单位:mm,注：“+”号表示不敏感，抑菌圈直径在7mm10mm ；“+”号表示敏感， 抑菌圈直径10mm15mm之间 ；“+”表示高敏感，抑菌圈直径大于15mm 。,小结,13,经分离菌的形态、染色、培养特性，从206份奶牛鲜粪样中共检出34株疑似金黄色葡萄球菌。生化试验、动物致病性试验和PCR鉴定结果表明，从34株疑似金黄色葡萄球菌中，供分离出7株致病性金黄色葡萄球菌，致病菌检出率为20.59。丹参、大黄、枸杞等3种草药对金黄色葡萄球菌高敏感,茜草和青蒿敏感，其它草药对金黄色葡萄球菌不敏感。,试验二 牛粪堆肥中添加石灰氮对金黄色葡萄球菌的杀灭效果,14, 培养温度的确定,试验设计 培养温度分别为20C、30C、37C和50C，石灰氮的添加量为0%和2%，即处理组添加2%的石灰氮，对照组不加石灰氮。 测定方法 取300g牛粪按上述比例的石灰氮混合均匀，分别在4个不同温度点静置培养10d。在培养0d、1d、3d、5d、7d和10d，分别采1g样品用平板计数法测定其金葡菌的数量。,15, 石灰氮添加量的确定,试验设计 根据培养温度的检测结果，选择最佳培养温度（即30），石灰氮的添加量设为0%、2%、2.5%、3%。 测定方法 取300g牛粪按上述比例的石灰氮混合均匀，在30培养5d。在培养0d、1d、3d和5d，分别采1g样品用平板计数法测定其金黄色葡萄球菌的数量。,16,结果,图4 牛粪堆肥中添加0%石灰氮 时金黄色葡萄球菌对数值的变化,图5 牛粪堆肥中添加2%石灰氮 时金黄色葡萄球菌对数值的变化, 培养温度的确定,在同一堆肥时间30金葡菌数低于20和37的金葡 菌。因此，30 是最佳培养温度。, 石灰氮添加量的确定,17,图6 牛粪堆肥中添加石灰氮 时金黄色葡萄球菌对数值的变化,在30培养时，添加2.5%石灰氮即可杀灭金葡菌。,小结,18,石灰氮主要靠分解为尿素过程中所产生的中间产物氰氨和双氰氨来杀灭病原微生物，其杀菌成分氰氨和双氰氨的分解速度受温度和水分的影响。37和50时石灰氮的杀菌成分分解速度快、杀菌效果不能持续，另外37也适合金黄色葡萄球菌的繁殖。而50的高温堆肥条件在实际中很难控制，且在同一堆肥时间30金葡菌数明显低于20和37的金葡菌数。因此，30是最佳培养温度，有助于发挥石灰氮的抑菌作用。 在30温度下要达到彻底杀灭金黄色葡萄球菌的目的，在牛粪堆肥中至少添加2.5%的石灰氮。,19,试验三 牛粪堆肥中添加石灰氮对堆肥发酵的影响, 材料 堆肥原料：牛粪，石灰氮 试验场地：内蒙古农业大学牛生产实验室。 试验设计 对照组0%，处理组石灰氮的添量分别为2%、3%、4%，即试验组0%、2%、3%、4%。,20, 堆肥样品采集 分别于第0d、3d、7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d ,五点采样，每次采样300g，混合均匀。 测定指标 温度：将水银温度计插入堆体中心部位，每天上午和下午读数，取两次读数的平均值。 含水率：105烘24h后称重。 PH值：称取试样10g，加50ml去离子水，经30min震荡，静置30min，用PH计测定。 总有机碳：采用KCI浸提-蒸馏法。,21, 有机质测定：总有机碳1.724。 全氮 ：采用凯氏定氮法。 C/N：总有机碳量与全氮的比值。 种子发芽指数：把一张大小合适的滤纸放入灭菌的培养皿中,均匀放入15粒白菜种子,吸取6ml的浸提液于培养皿中,以蒸馏水作对照,每个处理3次重复,在25的恒温培养箱中培养5d,测定种子发芽率和根长。 处理平均发芽率处理平均根长 发芽指数GI(%) = 100% 对照平均发芽率对照平均根长 大肠杆菌数：采用稀释平板法。 金葡萄球菌数：采用稀释平板法。,22, 堆体温度的变化,图7 堆肥温度的变化,结果,对照组0%比处理组2%、3%、4%升温快，对照组0%堆肥后第3d堆体温度上升到最高温39.8，而处理组2%、3%、4%分别在堆肥的第14d、15d和18d达到最高温度40.50、44.80和38.10。试验组历经高温之后就进入了长时间的降温腐熟阶段。, 水分含量的变化,图8 含水率的变化,水分含量基本呈下降趋势，且处理组2%、3%、4%的下降幅度大于对照组0%。在堆肥开始时水分均维持在71%76%之间，水分含量比较高。到堆肥结束时各试验组的水分基本稳定在60%左右。,23,24, PH值的变化,图9 PH值的变化,各试验组pH值均随着堆肥时间的延长而逐渐降低。堆肥结束时各处理组pH值均基本稳定在7.008.00左右，符合堆肥腐熟pH值应在7.008.00之间的标准。, 总有机碳的变化,图10 堆肥总有机碳的变化,25,各试验组总有机碳含量均在开始堆肥后的第3天下降幅度最快，说明有机碳是被微生物优先利用的碳源。最后其含量均维持在较低水平。各试验组的总碳含量均呈现下降趋势，但由于堆肥过程也会有较多氮损失，且牛粪中含有大量难以分解的如纤维素等有机物质，故总体而言总碳含量变化不大。, 有机质的变化,图11 堆肥有机质的变化,26,在整个堆肥过程中，试验组堆体中有机质含量都随着时间延长而逐渐下降。在堆肥初期有机质降解速度快，在降温期有机质变化不大。至堆肥结束时，四个试验组堆体有机质含量分别下降到39.24%、34.26%、33.41%和35.46%。, 全氮的变化,图12 堆肥T-N的变化,堆肥初期各处理组全氮略有减少，这是由于有机氮在此过程中强烈分解生成大量的NH3挥发所致。随着堆肥的进行，最后的腐熟化阶段，有机物分解速度降低，并趋于稳定，相对含氮量又逐渐上升，最终全氮含量较起始含量高。,27,28, C/N的变化,图13 C/N的变化,堆肥过程中，各试验组的碳氮比呈下降趋势。这是由于随着堆肥发酵的进行，总碳和全氮含量持续下降，但由于添加不同浓度石灰氮而使氮起始和最终的相对含量较高，使堆料的C/N逐渐减少。, 发芽指数的变化,图14 GI的变化,图15 白菜种子发芽,试验组0%、2%、3%和4%的初期发芽率分别为20.87%、2.56%、0.49%和0%。根据资料，种子发芽指数大于80%时，堆肥被认为已达到腐熟。,29,30, 大肠杆菌数的变化,图16 堆肥大肠杆菌对数值的变化,31,小结,堆肥是杀灭粪便病原微生物非常有效的手段，但处理不当仍可能有环境与公共安全的风险。本试验石灰氮的添加起到快速杀灭大肠杆菌的效果。0%对照组堆体温度迅速升高，而2%、3%和4%各处理组高温出现推迟现象，但大肠杆菌迅速达到检出界限以下。随着石灰氮添加量的增加2%、3%和4%各处理组总有机碳下降幅度不大，全氮的增加量逐渐减少，种子发芽指数提高。各组堆肥结束时均已达到腐熟。, 致病性金黄色葡萄球菌的检出率为20.59%；丹参、大黄、枸杞等3种草药对金黄色葡萄球菌抑菌效果较强，其中丹参对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最强。 30是杀灭金黄色葡萄球菌的较理想温度；在此温度条件下要达到彻底杀灭金黄色葡萄球菌的目的，牛粪堆肥中至少添加2.5%的石灰氮。 石灰氮的添加起到快速杀灭大肠杆菌的效果。对照组0%堆体温度迅速升高，而2%、3%和4%各处理组高温出现推迟现象，但大肠杆菌迅速达到检出界限以下。2%、3%和4%各处理组总有机碳下降幅度不大，全氮的增加量逐渐,32,全文结论,减少，种子发芽指数提高。各组堆肥结束时均已达到 腐熟。,33,34,感谢我的恩师敖日格乐教授，在三年的学业生涯中的精心指导与关怀，借此机会，向恩师道声诚挚的谢意。 感谢在坐的每一位老师和同学！,致 谢,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用,主要经营：网络软件设计、图文设计