课件：牛奶中金黄色葡萄球菌的鉴定.ppt

检测牛奶中是否感染有金黄色葡萄球菌并鉴定,,实 验,实验目的 实验原理 实验仪器、试剂与材料 实验步骤 实验结果 参考文献,实验原理,1、认识金黄色葡萄球菌； 2、学习运用PCR方法检测金黄色葡萄球菌。,金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)属于葡萄球菌属（Staphylococcus），无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37C，最适生长pH7.4,干燥环境下可存活数周。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径12mm。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径12mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在1015%NaCl肉汤中生长,显微图像,金黄色葡萄球菌革兰氏染色显微照片,实验原理,微生物学方法是鉴定牛奶中病原菌的“金标准”，传统方法是进行细菌分类培养，通过生化试验、血清型、各种酶试验分析细菌的表型特点。对牛奶中病原微生物培养需要很长时间 用生化试验的方法进行种属特异性的鉴定至少需要48h以上传统的鉴定技术时间较长，从国外进口诊断试剂费用相对较高。因此，本文建立了直接从牛奶中鉴别病原菌的PCR检测技术，这种快速、准确、有效、直接从牛奶中检测致病菌的方法将为检验检疫、食品安全质检系统以及兽医检疫提供技术支撑，从而为乳制品病原菌的检测提供一定的帮助。,方法是根据已发表的金黄色葡萄球菌16-23SrRNA特异性序列设计并合成一对引物，通过优化反应条件建立从牛奶中直接检测金黄色葡萄球菌的PCR方法。 结果是与细菌的常规分离方法相比，PCR 法敏感性高与其它型葡萄球菌无交叉反应，特异性达100%，检测细菌基因组DNA最低浓度为35ng/L（纳克每升） ，能在5h内对送检的牛奶样品直接进行金黄色葡萄球菌的测定，可用于乳制品中金黄色葡萄球菌的检测。 所以，建立了一种直接从牛奶中检测金黄色葡萄球菌的PCR快速诊断方法。,实验仪器、试剂与材料,仪器：冰箱、摇床、显微镜、PCR反应管、PCR仪、微量加样器、高速离心官、水平电泳槽、恒压电泳仪和凝胶自动成像系统、紫外检测仪、电热恒温水浴槽。 材料：某牛奶样品、金黄色葡萄球菌标准株。,试剂： 主要培养基：贝尔德.帕克氏(BP)培养基、血平板培养基、普通营养琼脂培养基、7.5%NaCl营养肉汤、LB液体培养基（又称Luria-Bertani培养基、普通培养基）。 溶菌酶（20mg/ml）、蛋白酶K（20mg/ml）、10%SDS、5mol/L NaCl、酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）、氯仿:异戊醇(24：1)、乙醇、草酸铵结晶紫染液 、卵黄亚碲酸钾、TE缓冲液（Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25）。,10倍PCR反应液：400 mmol/L HCL、100 mmol/L Tris-HC（pH 8.4）、20 mmol/L MgCl2、0.1 g/L 明胶或牛血清白蛋白。 10mmol/L dNTP、Taq DNA聚合酶（2.5U/L）、上下游引物（25 pmol/L）、电泳缓冲液（1倍TAE）、标准DNA（DNA Mark-er）、1%琼脂糖、0.5g/mL溴化乙锭。,实验步骤,1、细菌的增菌培养及初步鉴定 2、细菌DNA提取 3、PCR扩增鉴定,1、细菌的增菌培养及初步鉴定,1.1 增殖培养： 在无菌操作下各取10mL牛奶样品加入90mL7.5%NaCl营养肉汤中,37、180r/min条件下培养24h。 1.2 分离培养及初步鉴定： 将上述培养液按十倍稀释,取稀释液涂布于BP培养基上,每个稀释度3次重复。37倒置培养24h，观察。,看是否有菌落呈圆形、表面光滑、凸起、湿润，直径2-3mm,灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色（非白色）的边缘，周围绕以不透明圈（沉淀），其外常有一清晰带（卵磷脂环）。,若没有，则可断定牛奶样品没有感染金黄色葡萄球菌，此时已经可以结束实验。 若有，则挑取表面光滑、边缘完整、黑色突起的菌落于普通琼脂培养基上,分离纯化3次后,用草酸铵结晶紫染液进行革兰氏染色观察细胞的个体形态特征。选择呈革兰氏阳性、球状、葡萄串状排列无芽胞、荚膜的菌株,斜面培养后保存于4冰箱中备用。,2、细菌DNA提取,以常规方法进行S.aureus标准菌株、对照菌株以及牛奶样品中基因组DNA的提取。,取经过上述初步鉴定为金黄色葡萄球菌的菌种接种于LB液体培养基中,37、180r/min条件下培养12h,取3-6ml培养液10000r/min离心10min,弃上清； 加0.5mlTE悬浮沉淀,并加75l溶菌酶（20mg/ml）溶液，40保温30分钟； 加50l,10%SDS,5l蛋白酶K（20mg/ml）,混匀,37保温30分钟； 加0.75ml,5mol/LNaCl,混匀；,用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管； 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提,静置10分钟，5000转离心10分钟，转移上清到干净管中； 加2倍体积乙醇沉淀DNA,颠倒混合,室温下静止10分钟，离心沉淀DNA； 70%乙醇漂洗DNA后,吸干,用30-50l TE溶解DNA,-20保存。,3、PCR扩增鉴定,根据有关文献选取特异性核苷酸序列设计1对引物，由xx公司合成如下：S.aureus上游引物P1：5-TCTTCAGAAGACGCGGAATA-3，下游引物P2：5-TAAGTCAAACGATACCATACG-3。 分别从S.aureus标准菌株、对照菌株以及牛奶样品中提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增。,样本DNA扩增的PCR反应体系（25L）：10buffer2.5L，上下游引物（25pmol/L）各1L，2.5L dNTP(10mmol/L，dATP、dCTP、dGTP和dTTP)，rTaq聚合酶0.25L，DNA模板1L，ddH2O补至25L。 PCR循环条件为：95预变性5min，95变性1min，57退火50s，72延伸 50s，扩增36个循环，最后72延伸10min。 取PCR扩增产物5L进行1.5%琼脂糖凝胶电泳（含EB0.5%g/mL），电泳结束后，在紫外灯下观察并用电泳图像分析系统拍照，记录试验结果,PCR产物测序结果表明若如上两图类似情况，该基因片段长度为420bp左右，则说明此牛奶以感染金黄色葡萄球菌；若不是，则感染的不是金黄色葡萄球菌，需进一步鉴定。,参考文献, 1 陆承平.兽医微生物学.4版.北京：中国农业出版社，2007.8. 2 张云贵，刘祥云，李天俊主编.生物化学实验指导.4版. 北京：中国农业出版社，2007.12. 3 覃艳华,谢和,胡萍,李荔枝.原料奶中金黄色葡萄球菌分离鉴定及产毒菌株的快速检测. 贵州农业科学，2011.39(5:140143. 4 吕艳，王华，王君玮，徐天刚，王淑娟，赵永刚，王志亮.牛奶中金黄色葡萄球菌PCR检测方法的建立与应用. 现代生物医学进展.2009.9(3:931933., 5 王娉，劳华均，胡玥，袁飞，杨海荣，陈颖.鉴定金黄色葡萄球菌的多重PCR方法.食品与发酵工业，2011.37 (9:195198. 6 何娟梅，朱军，巢国祥，朱晓芳，朱小平，董兰梅，杨伟霞，朱国强. 一株金黄色葡萄球菌小菌落突变株的分离鉴定. 微生物学报，2009.49(10:13971402.,,谢谢!,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用,主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！,致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策