课件：发育毒性和致畸作用.ppt

第九章 发育毒性与致畸作用,畸胎学（古代） 现代实验畸胎学（十九世纪） 发育毒理学（二十世纪）,第一节 概 述,Teratology (畸胎学) 来自于希腊语monster (怪胎) ，即 teras (畸胎) 。 1651年，William Harvey提出发育障碍学说：畸形起因于器官或结构的不完全发育。,作用时间在决定畸形类型方面比损伤性质(哪种物理化学因素所致损伤)更重要。,致畸作用因素,电离辐射 化学物和药物 病毒细菌感染 吸烟酗酒 母体代谢失调,四环素牙,牙齿变黄，牙釉质发育不良（牙齿表面不光滑，出现小凹陷）或牙齿畸形。,先天性水俣病患者,甲基汞侵入脑神经细胞而引起的一种综合性疾病,反应停(thalidomide)事件 孕妇的理想选择？ 1953年，联邦德国一家名为Chemie Gruenenthal的制药公司研究人员发现， 反应停（沙立度胺）具有一定的镇静安眠作用，而且 对孕妇怀孕早期的妊娠呕吐疗效极佳。 1957年10月1日该公司将反应停正式推 向市场。,当时反应停成了“孕妇 的理想选择” ，在欧 洲、亚洲、非洲和南美洲被医生大 量处方给孕妇以治疗 妊娠呕吐。,科学家们在研制反应停时，并没有料到这种药物会产生如此可怕的副作用。,令人恐怖的副作用 到了1960年，欧洲的医生 们开始发现，本地区畸形婴儿的出生率明显上升。这些婴儿有的是四肢畸 形(主要是双上肢的短肢畸形)，有的是腭裂，有 的是盲儿或聋儿，还有 的是内脏畸形。, 调查显示，孕妇在末次月经后第 34 50天是反应停作用的敏感期。 在此时间段以外服用反应停，一般不会导致胎儿的出生缺陷。 支付巨额赔偿金 1970年4月10日，案件的控辩双方于法庭外达成了和解，Chemie Gruenenthal公司同意向控方支付总额1.1亿德国马克的赔偿金。,发育毒理学(developmental toxicology),研究出生前暴露于环境有害因子导致的异常发育结局及有关的作用机制、发病原理、影响因素和毒物动力学等。,第二节 发育毒性与致畸性,一、基本概念 1、畸形(malformation)：在指出生前因素引起发育生物体严重的解剖学上的形态结构异常。分为严重畸形和轻微畸形。对发育、生长、形态、生理功能、生育力和寿命产生有害影响。可能存活也可能不存活。 致畸性(teratogenicity)和致畸作用(teratogenic effect)：在妊娠期接触外源性理化因素引起后代结构畸形的特性或作用。 致畸物（致畸原teratogen）：妊娠期接触能引起子代畸形的环境因子。,2、变异(variation)：指同一种属的子代与亲代之间或子代的个体之间，有时出现不完全相同的现象，是小的或次要的结构改变。 一般认为变异不影响正常生理功能，更不危及生命。 变异是生命的一种特征，在生物学上具有适应与进化的意义，变异并非畸形，但有时与畸形难于严格区分。在致畸试验中，如果某种变异出现较多，而且呈现一定剂量效应或反应关系，应引起注意。,3、胚体-胎体毒性 胚体毒性 embryotoxicity：通常指外源性理化因子对孕体着床前后直到器官形成期结束时的有害影响。 孕体:从受精卵直到出生的整个发育生物体，包括胚体、胎儿（胎体）和胎膜。 表现为：胚体期染毒而出现畸胎、生长迟缓、着床数减少和吸收胎，也偶有死胎。 胎体毒性(胎儿毒性 fetoxicity) ：指对孕体器官形成期结束后的有害影响。 包括胎儿死亡、体重降低、骨化迟缓、功能缺陷以及结构异常，甚至肿瘤。,在实验动物发育毒性试验中，通常不去区分胎儿与胚体，所以使用胚胎毒 性（embryo-fetal toxicity）更恰当。 广义的说胚胎毒性包括孕体结构和功能方面的各种损害，一般情况下，胚胎毒性是指孕体的死亡和生长发育迟缓，而不包括结构畸形。,4、发育毒性（developmental toxicity）:出生前经父体或（和）母体接触外源性理化因素，引起在子代到达成体之前这段时间内出现的有害作用。 发育毒性具体表现: 生长改变：一般指生长迟缓，胚胎与胎儿发育在外来化合物的影响下，较正常的发育过程缓慢 结构异常：由于外来化合物的干扰，胎儿在出生时表现出形态结构异常，即畸形。 功能缺陷：胎儿的生理、生化、代谢、免疫、神经活动及行为的缺陷或异常。 发育生物体死亡：由于外来化合物的作用，在胚胎或胎儿发育期间对胚胎或胎儿产生损害，并致其死亡，具体表现为自然流产、死产，死胎率增加。,5、出生缺陷（birth defect） ：指婴儿出生前即已形成的发育障碍。 包括：畸形和功能缺陷。 畸形：形态结构异常。 功能缺陷：如智力低下，代谢和行为异常。 出生缺陷：如先天性心脏病、唇腭裂、神经管畸形、尿道下裂、隐睾症、低出生体重。 6、不良妊娠结局（adverse pregnancy outcomes）：妊娠后不能产生外观和功能正常的子代。包括所有的不良结果(如流产、死胎、死产、宫内生长迟缓、发育异常、新生儿和婴幼儿期死亡等)。,二、发育毒性作用的特点和影响因素,（一）发育各阶段发育毒性作用的特点 1、着床前期 2、器官形成期 3、胎儿期 4、围生期和出生后的发育期,1、着床前期,事件：从受精时算起，到完成着床之前。（发生受精、卵裂、进入子宫腔、囊胚形成、原肠胚形成及着床） 时间：人类为受精后的第1112天；啮齿类动物为前天。 特点：很少发生特异的致畸效应。也有例外，如甲基亚硝脲和环氧乙烷。小鼠妊娠第2.5天、3.5天和4.5天用甲基亚硝脲处理可造成子代神经管缺陷和腭裂。 这一发育阶段被称为早期不易感期。,2、器官形成期,事件：着床后孕体即进入该期，直到硬腭闭合。（细胞增殖、移动和组合形成器官原基，即细胞结构开始分化，并逐渐形成不同的器官和组织） 时间：人类为第38周；大鼠约为9-17天；小鼠7.5-16天；家兔11-20天。 特点：发生结构畸形的关键期。此期细胞增殖分裂速度很快，组织器官生长旺盛，胚胎对致畸物特别敏感，细胞受损可导致结构畸形、生长迟缓或胚胎死亡。 这一发育阶段被称为致畸敏感期或致畸作用危险期（critical period）。,人类胚胎的致畸敏感期,不同器官敏感期不同，且有交叉重叠。 表现为：不同器官致畸高峰时间不同，此期内不同时间给予致畸物会诱发不同器官畸形，同一天染毒可引起多个器官受损。,同一致畸物，给予时间不同，会产生不同的畸形。即同一剂量同种致畸物在敏感期中与胚胎接触，可因胚胎所处发育阶段不同而出现不同的畸形。 小鼠孕第8-12天的不同时间给予环磷酰胺，虽然均可引起足趾畸形，但是随着给药时间不同，分别出现多趾、并趾、缺趾、无趾。 大鼠静脉注射硝酸铅，第9.5天引起后部畸形，第10天可引起大鼠死亡。,事件：器官形成结束（以硬腭闭合为标志）后即进入该期。主要是。 时间：人类是从第56-58天起，直到分娩。 特点：组织分化、生长和生理学成熟，致畸物难以使之发生结构缺陷，通常是变形或异常而非畸形。 胎儿期接触外源性物的不良作用主要表现为：全身生长迟缓、特异的功能障碍、经胎盘致癌和偶见死胎。,3、胎儿期,研究较多的是：发育免疫毒性、神经行为发育异常和儿童期肿瘤。 围生期接触外源化学物，会严重影响胎儿T细胞、B细胞和吞噬细胞的发育、迁移、归巢及功能，可能暂时甚至永久性地损伤机体的免疫系统。 许多化学物质具有发育神经毒性，表现为对感觉、运动、自主和认知等方面的影响。 围生期是一生中对致癌物最敏感的时期。 这是由于细胞增殖快，药物代谢酶发育不全，免疫监视功能低。,4、围生期和出生后的发育期,（二）发育毒性的剂量反应关系模式：,A. 正常胎、生长迟缓和结构畸形同时存在，但较高剂量下几乎引起全窝胚胎死亡。（较常见）多为细胞毒性致畸物，包括烷化剂、抗癌药及很多致突变物。,剂量,同窝胎仔反应率,B. 在远低于胚胎致死剂量下即可出现致畸，甚至全窝致畸，致畸胎儿常同时出现生长迟缓。（高度致畸作用，较少见）如沙立度胺、糖皮质类固醇等。,发育毒性的剂量反应关系模式：,剂量,C. 只有生长迟缓和胚胎致死但没有畸形发生。,发育毒性的剂量反应关系模式：,剂量,（三）发育毒性的物种差异,发育阶段致畸效应的特异性： 胚胎所处的发育阶段不同，对于致畸作用呈现不同的敏感性。 有性生殖动物的着床前胚泡对致死作用较为易感，对致畸作用较差。 在胚胎发育后期和新生儿期的发育毒性表现为:生长迟缓、神经、内分泌及免疫系统机能的改变。 胎儿对致死作用的易感性较胚胎为低。,致畸的物种个体差异： 任何环境有害因素的损害效应都存在物种品系及个体差异，在致畸作用中较突出。 例如，杀虫剂西维因对豚鼠具有致畸作用，对家免和仓鼠并不致畸。 例如，农药敌枯双对大鼠致畸作用明显，但未得到人群调查的证实资料。 同一物种不同品系对一种致畸物敏感性的差别很大，反应停和脱氢皮质酮都有这种现象。,可能由于同一致畸物在不同物种和同一物种的不同品系动物的代谢过程有一定差异； 也可能由于致畸物主要是通过母体胎盘作用于胚胎，而不同物种动物胎盘构造也不相同。 这些差异可能是由于遗传因素，即基因型差异。,为什么会出现物种及种间差异？,三、母体毒性与发育毒性,（一）母体因素对发育毒性的影响： 母体毒性：化学毒物对妊娠母体产生的有害作用。 表现为增重减慢、功能异常、临床症状、甚至死亡。 目前常用增重减慢和死亡率来表示。,影响发育的母体因素：,1、遗传学：母体的遗传结构是胚胎发育的一个决定因素。如唇腭裂的发病率白种人明显高于黑种人，主要原因在于母体，而非胚胎本身的基因结构。 2、疾病：母体受病毒感染、未控制的糖尿病等疾病，将会对胚胎产生影响。如怀孕前三个月，母体高热、病毒感染等均可能导致胎儿中枢神经系统畸形。 3、营养：母体蛋白质、热量、维生素、微量元素及酶的辅助因子缺乏将对胚胎产生影响。,4、应激：不同形式的母体毒性可能通过诱导生理学应激反应而产生发育毒性。（噪声应激） 5、对胎盘的毒性：胎盘是母体和胚胎进行物质交换的结构，为胚胎提供营养、气体交换、废物排出。胎盘可产生维持妊娠关键的激素，而且能代谢和储存外源化学物。外源化学物既可透过胎盘进入胎儿体内，同时胎盘也可能是其作用靶点，或作为其储存库。,（二）母体毒性与发育毒性的关系,1、具有发育毒性，但无母体毒性（沙利度胺） 2、既有发育毒性，也有母体毒性（乙醇、可卡因） 3、具有母体毒性，但不具有发育毒性（引起警觉） 4、既无母体毒性，也无发育毒性（一定剂量范围内）,四、父源性发育毒性,父源性出生缺陷（paternal birth defect） 引起父源性出生缺陷的因素主要有：遗传缺陷、年龄因素和外界暴露因素。 父源性暴露引起子代发育异常包括：自然流产、死胎、低出生体重、畸形、功能障碍等，男女出生比例失调，甚至可能与儿童肿瘤相关。,五、已知人类的发育毒物或致畸物 六、联合发育毒性,第三节 致畸（发育毒性）作用机制,1、不发育(agenesis) 由于某些重要的原基组织(primordial tissue)不存在或缺乏邻近组织或前体组织的正常诱导而使原基组织不发生，结果某个器官或躯体部分发生或完全缺如。 2、发育不全(hypoplasia) 这种畸形常在名词前冠以“小”字，如小头、小眼等。此外，亦有软骨发育不全等。 3、发育受阻 某器官或结构发育至半途时受阻而停止，可分为四类：不合并(non-fusion）；不分裂(non-division），如动脉干永存；抑制迁移(sup-pressed migration）；暂时性结构的保存(persistence of transitory structure），如肛门闭锁、憩室等。,先天畸形的发生方式,4、相邻原基粘连 如马蹄肾，或原基分裂如分裂输尿管。 5、生长过度（overgrowth） 如多指、巨指或先天性角化过度等。 6、错位（misplacement） 如内脏错位等。 7、错误迁移（incorrect migration） 如卵巢迁移到外生殖器，并耳等。 8、不典型分化(atypical differentiation） 包括先天性肿瘤的形成、异位和分化。 9、返祖（atavism） 常见的有多毛、复乳等。,畸形的引发机制,1、基因突变与染色体畸变 2、干扰基因表达 3、细胞损伤与死亡 4、干扰细胞间的交互作用 5、通过胎盘毒性引起发育毒性 6、干扰母体稳态 7、发育免疫毒性机制 8、发育神经毒性机制,影响化学致畸作用的因素：,致畸物的理化因素：如脂溶性 化学物作用的时机：器官形成期对致畸影响最大 化学物作用剂量、接触频率 种属差异和个体差异：种属、品系 其他因素：染毒途径、母体年龄及营养状态,第四节 发育毒性和致畸试验与评价,外源化学物发育毒性的评价需要四方面的资料： 环境流行病学资料 控制下的临床研究资料 动物发育毒性试验资料 体外试验资料 作为一个新产品的登记与审批，主要根据前三类资料。在前三类资料中，首先是动物实验资料，因为大多数情况下新产品在上市前，还没有流行病学资料和控制下的临床资料。,一、动物发育毒性试验,优点：容易控制接触条件，控制接触动物的数量、年龄、状态以及选择检测效应指标（终点）。 缺点：动物实验结果外推到人具有不确定性。,生殖发育过程可分为6个阶段,A. 从交配前到受孕：检查成年雄性和雌性生殖功能、配子的发育与成熟、交配行为、受精。 B.从受孕到着床：检查成年雌性生殖功能、胚胎着床前发育、着床。 C.从着床到硬腭闭合：检查成年雌性生殖功能、胚体发育、主要器官形成。 D.从硬腭闭合到妊娠结束：检查成年雌性生殖功能、胚体的发育与生长、器官的发育与生长。 E.从出生到断乳：检查成年雌性生殖功能、新生仔对宫外生活的适应性、断乳前的发育与生长。 F.从断乳到性成熟：检查断乳后的发育与生长，对独立生活的适应、达到完全的性功能。,三段生殖毒性试验,生育力和早期胚胎发育毒性试验（一般生殖毒性试验） 胚体-胎体毒性试验(致畸试验) 出生前后发育毒性试验(围生期毒性试验),三段生殖试验图解 . 生育力和早期胚胎发育毒性试验（一般生殖毒性试验） . 胚体-胎体毒性试验（致畸试验） . 出生前后发育毒性试验（围产期毒性试验）,（一）I阶段试验：交配前染毒 生育力和早期胚胎发育毒性试验（一般生殖毒性试验）,研究目的：评价化学毒物对配子发生和成熟、交配行为、生育力、胚体着床前和着床的影响。 实验动物：至少一种，首选大鼠。最好另选家兔，研究避孕药还要用猴子试验。每组雌雄各1620只。 染毒时间：交配前，雄性给药4周，雌性给药2周，雌性受孕后继续给药至器官形成末期。 处置：雄性证实交配并使雌性受孕成功后处死，雌性在受孕1315天终止妊娠。 观察指标：孕鼠妊娠体重变化，处死后检查黄体数、着床数、吸收胎、死胎数、畸胎数和活胎数。 计算：雌鼠受精率、妊娠率、着床前死亡率,动物发育毒性试验,（二）II阶段试验：器官形成期染毒 胚体-胎体毒性试验（传统致畸试验）,从着床到硬腭闭合期间染毒，研究对成年雌性生殖器功能、胚胎发育、器官形成期的发育毒性。 研究目的：评价受试物的胚体-胎体毒性和致畸性。 1、传统致畸试验中动物的选择：食性和对受试物代谢过程与人类接近，易饲养、易繁殖和价廉之外，还应特别注意妊娠过程较短、每窝产仔数较多以及胎盘构造与人类接近的动物。 致畸试验通常两种哺乳动物，一般首先考虑大鼠，此外为小鼠或家兔。每组雌雄各1620只（窝）。,动物发育毒性试验,大鼠受孕率高，易于得到足够标本数，且大鼠对大多数外源化学物代谢过程、基本与人类近似。但不足之处是大鼠对一般外源化学物代谢速度很高，对致畸物耐受性强、易感性低，有时出现假阴性结果。 小鼠自然畸形发生率较大鼠高。对形成腭裂的致畸物更较为敏感。 家兔为草食动物，与人类代谢功能差异较大，妊娠期不够恒定，自然发生率也较高。 鸡胚也可进行致畸试验，可同时得到大量鸡胚，胚胎发育条件也较易控制。但鸡胚不是哺乳动物，缺乏受试物与母体的相互作用。,2、传统致畸试验剂量分组,在确定计量时，一方面要求找出最大无作用剂量以及致畸阈剂量，同时还要保持母体生育能力，不致大批流产和过多胚胎死亡和避免母体死亡。一般应先进行预试验，根据预试结果确定正式试验剂量。 正式试验最少应设3个剂量组，另设对照组。 高剂量组该剂量一般不超过LD50的1/5-1/3，应引起母体轻度中毒，即进食量减少、体重减轻、死亡不超过10%； 低剂量组可以为LD50的1/100-l/30，不应观察到任何中毒症状； 中剂量组可以允许母体出现某些极轻微中毒症状，其剂量与高剂量和低剂量成等比级数关系。,将性成熟雌雄动物按雌雄1:1或2:1的比例同笼交配。每日将已确定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。 每组至少有20只怀孕雌鼠存活。,3、传统致畸试验动物交配处理,4、传统致畸试验染毒 在受孕大鼠器官形成期给予受试物。,5、传统致畸试验胎仔检查及处置 在自然分娩前1-2日将受孕动物处死剖腹，取出子宫及活产胎仔，记录死胎和吸收胎。一般大鼠在受孕第19-20天，小鼠为18-19天，家兔在第29天。 胎仔一半茜素红染色，观察骨骼，另一半Bouins液固定，观察内脏。,6、传统致畸试验观察指标 临床症状、孕鼠体重与增重，饲料摄食量，黄体数，着床数，吸收胎、胎仔活胎数，性别比例，活胎重量，死胎数，外观畸形，骨骼畸形和内脏畸形。 畸形检查 外观畸形肉眼检查，例如露脑； 肉眼检查内脏及软组织畸形，如腭裂； 骨骼畸形检查，例如颅顶骨缺损等。 7、传统致畸试验结果评定：母体毒性及NOAEL，胚胎毒性、致畸性及NOAEL。,从着床到幼仔期间对孕鼠染毒 研究目的：从着床到子代性成熟的母体生殖毒性（成年雌性生殖功能：妊娠，分娩和哺乳）和子代的发育毒性（胚胎，胎儿生长发育，新生幼仔宫外生活的适应性，断乳前后的生长发育，独立生活能力和性功能成熟。） 实验动物：至少一种，首选大鼠，每组雌雄各1620只 染毒：雌性从着床到哺乳期结束，大鼠孕15天至产后28天。 处置：孕鼠在断乳期末，产后28天检查新生胎数。 观察指标：着重检查新生胎数的存活与发育，也包括孕期流产，产程，哺乳情况 具体指标：出生存活率，4天存活率，21天存活率，出牙，开眼，睾丸下降，阴道开口，行为反射指标。,（三）III阶段试验：出生前和出生后发育毒性试验 （围生期毒性试验）,动物发育毒性试验,动物试验的缺点：,1、动物实验结果外推到人的不肯定性： 由于致畸作用存在种属差异和品系差异，故对一种受试物须多次重复同一实验，均出现一定畸胎发生率，才能认为畸胎发生与该受试物有关。 至少应能在两种以上实验动物的实验中都显示肯定能够的致畸作用才能可靠的推导于人。 但只要受试物在一种动物具有致畸作用，就应警惕它对人类具有的潜在危险性。,2、动物高剂量接触与人类实际低剂量接触的区别 阿司匹林和磺胺类药物对大鼠有致畸作用，但这些药物人类已长期使用，并未发现肯定的致畸作用，可能是人所利用的剂量未达到可引发致畸的程度。 维生素A常用作致畸的阳性对照物，给大鼠1000mg/kg剂量可引发畸胎，按此剂量推算，50kg体重的人每天应服用50ml的鱼肝油，才会产生致畸作用，而人类很难摄取如此大量的鱼肝油，故到目前为止，维生素A并未被列为人类的致畸物。 一定要考虑人类的实际接触剂量。此外更要重视流行病学的调查，设法收集接触者的流行病学及临床资料，只有将动物实验结果与流行病学调查资料结合起来，进行综合分析，才能得出正确的结论。,动物试验的缺点：,对大多数化学物质来说，三段生殖毒性试验设计通常是最适当的，关键因素是各个生殖阶段之间不得有间隔，即在三个有关联的阶段接触受试物的时期至少有一天的重叠，并能直接或间接地评价生殖过程的所有阶段。,二、人群流行病学研究,（一）人类证据的获得 流行病学调查：在接触外来化合物的人群中进行调查。调查的观察指标可参照有关的临床诊断检验指标，还可进行染色体畸变检查。,（二）发育毒性资料的使用,1、化学物致畸潜力分类和安全系数确定 2、ICH人类用药危险度分类 3、根据动物试验人群调查资料对致畸物分级 4、确认人类致畸物的标准,人群流行病学研究,1、化学物致畸潜力分类和安全系数确定 根据动物试验中发育毒性效应的类型、严重性和发生率将化学物分为四类，并规定各类型的不同的安全系数范围，用以评定待测物发育毒性的危险度。,国际生命科学院(International Life Sciences Institute,ILSI) 1989年提出,2、ICH人类用药危险度