课件：血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳.ppt

血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳,第六组,蛋白质的分离,蛋白质是生物大分子化合物，具有胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点 蛋白质分离纯化的方法主要有：盐析、透析、超离心、电泳、离子交换层析、分子筛层析等方法。,透析,超速离心,凝胶过滤层析,离子交换层析,电泳技术的原理,电泳蛋白质在一定的pH溶液中可带有电荷，成为带电颗粒，在电场中向相反的电极方向泳动。由于蛋白质的分子量和电荷量不同，其在电场中的泳动速率也不同，从而将蛋白质分离成泳动速率快慢不等的条带。 电荷的来源 蛋白质带有可解离的氨基（-NH2）和羧基(-COOH),是典型的两性电解质，在一定PH条件下会解离带上电荷,COO- COO- COOH + H+ + H+ Pr Pr Pr + OH- + OH- NH2 NH3+ NH3+ PHPI PH=PI PHPI,迁移率 电场力 F=EQ （E：电场强度， Q：电荷) 阻力 F=6 （：半径，：介质粘度） /E表示单位电场强度时粒子运动的速度，称为迁移率 ，也称位泳动度，以表示： = /E=Q/ 可见，离子的迁移率在一定条件下取决于粒子本身的性质， 即其所带的电荷和形状。不同的粒子有不同的迁移率，因此 电泳一定时间就可分开它们。,样品性质 与分离样品所带电荷成正比，与样品相对分子质量成反比。 电场强度 电压越高，带点粒子移动越快。 缓冲液的性质 缓冲液的PH值距等电点越远指点所带静电荷越多，迁移速度越快；反之越慢。离子强度等于1/2cizi2 支持介质 理想电泳支持介质应是网状结构、不带电荷、对被分离物质无吸附作用的惰性材料。 温度,影响电泳分离效果的因素,电泳的分类,1、根据固体支持物种类的不同 纸质电泳 醋酸纤维素薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 2、根据电泳装置不同 薄膜电泳 垂直板电泳 平板电泳 垂直圆盘电泳,醋酸纤维素薄膜电泳,琼脂糖凝胶电泳,琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场力作用下能产生较强电渗作用，因此用于作为电泳支持物。琼脂糖凝胶电泳具有：操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳；电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；可直接用于紫外检测；易染色易洗脱等优点。尤其适合核酸的分离。,琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰氨凝胶电泳,实验目的 1、掌握电泳的基本原理，了解电泳仪、电泳槽的基本结构与功能。 2、熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本过程。,实验原理,聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成1225个组分。因此适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。 根据有无浓缩效应可分为：连续系统与不连续系统，其中不连续系统因具有浓缩效应，分离条带清晰度及分辨率较佳应用更为广泛，本次试验应用的为不连续系统。,三大效应,浓缩效应：浓缩胶的浓度小于分离胶的浓度，因凝胶孔径的不连续使样品迁移受阻而压缩成很窄的区域，从而提高分离效果。缓冲液离子成分、PH的不连续性也能造成浓缩效应：电极缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液，样品及凝胶（浓缩胶）中缓冲液为pH6.7 Tris-HCL缓冲液。电极缓冲液的pH=8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩。1cm厚样品层可以压缩0.25m的厚度。 分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。当样品进入分离胶，凝胶孔径变小，分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。 电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。电荷越多迁移越快,不连续系统,有效迁移率 = 迁移率 解离度 氯离子蛋白质阴离子甘氨酸阴离子,垂直板电泳的优点：,表面积大而薄，便于通冷却水以降低热效应，条带更清晰。 可多个样品的电泳 胶板制作方便，易剥离，样品用量少，分辨率高。 胶版薄而透明，可制成干板，便于长期保存与扫描。 可进行双向电泳。血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中，只可以分离出56条区带，而在聚丙烯酰胺凝胶电泳中可分离出数十条区带。,实验器材与试剂 器材 圆盘电泳槽、电泳仪、脱色摇床、染缸、微量加样器、注射器、小烧杯 试剂（缓冲液PH值准确配置后用PH计调试）,实验操作 凝胶柱的准备,（凝胶溶液配制表见教材表4-4）,取玻璃管，一段封口,加入分离胶溶液(7cm),加入蒸馏水,制备分离胶应迅速,为了使表面平整，与空气隔绝,加入分离胶溶液(7cm),制备分离胶应迅速,加入分离胶溶液(7cm),制备分离胶应迅速,加入分离胶溶液(7cm),制备分离胶应迅速,取玻璃管，一段封口,取玻璃管，一段封口,取玻璃管，一段封口,装柱 将凝胶管插入电泳槽槽底橡胶塞孔中，加入电极缓冲液与下电泳槽，随后放入凝胶管及上槽，除气泡(上电极槽以电极和凝胶管完全浸入为宜，下电极槽以凝胶管浸入3/5为宜),加样 取血清12L ，7号试剂12L混匀，品均加入4管，每管6L.（加样枪不可插入过深，以免刺破凝胶，同时要缓慢、均匀，以免搅动缓冲液引起样品扩散。） 电泳 接通电源，上负下正，先调节电流1mA/管，待示踪染料进入分离胶后调节为23 mA/管，待示踪染料离管下口0.5cm时切断电源。 剥胶 注入蒸馏水做润滑剂，针头螺旋式前进，缓缓剥离。 固定、染色及漂洗 将凝胶柱浸入8号剂中泡10min，进行固定，用9号剂染色10min，用清水冲洗，放入10号剂中漂洗脱色。,结果示意图, 2 1,注意事项：,丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，用前检测pH值是否失效。失效液不能聚合。 加速剂（TEMED）要密封保存，过硫酸溶液现配现用，防止氧化失效。 配好胶后应尽快灌胶（不要形成气泡） 切记装柱后应用蒸馏水密封 灌胶和电泳时要注意排气泡 加样时不能损伤凝胶表面 电泳时凝胶管不能漏水，并且与电泳池垂直 固体胶切忌倒入水池,The end!,谢谢！,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用,主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！,致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全