课件：与比较.ppt

CE-SDS(非还原）与SEC-HPLC方法比较,报告人：袁梵雨、谢敏、娄昆、陈小龙,CE-SDS(非还原法）,原理简介：,毛细管电泳是以高压直流电场为驱动力，以毛细管为分离通道。毛細管內先填充凝胶，此时凝胶会在毛細管內形成分子筛，样品依分子量的大小在毛細管內移动速度不同而进行分离，能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。,CE-SDS(非还原）,仪器组成,毛细管电泳系统的基本结构包括进样、填灌/清洗、电流回路、毛细管/温度控制、检测/记录/数据处理等部分。,CE-SDS(非还原）,检测器,CE-SDS(非还原）,进样方式,1. 流体力学进样方式 （1）进样端加压 （2）出口端抽真空 （3）虹吸进样,进样量：毛细管长度的1%-2%；nL级、非常小；,2. 电动进样方式 毛细管一端插入样品瓶，加电压。,3. 扩散进样 试样通过扩散作用进入分离柱端口处。,CE-SDS(非还原）,工作电压的确定,1、在电泳条件下，改变电压（或电流）测定对应的电流（或电压） 2、做电压电流曲线 3、取线性关系中的最大电压（或电流），作为分离电压（或电流）。线性以上的电压，焦耳热效应过大，一般不宜选用。但如果分离效率很高，就可以选用，以便加快分离速度。在做CGE时，电场强度应控制在150400V/cm之间，否则容易导致凝胶的破坏。,电泳温度的选择,电泳温度的选择，主要是指毛细管外表温度的选择与控制。温度变化不仅影响分离的重现性，而且影响分离效率。温度选择应考虑：热效应控制、重现性控制、分离效率控制盒分离介质对温度的限制等因素。多数情况下，在2030之间进行电泳，就能获得良好的分离结果。,各试剂的作用,SDS-MW Sample Buffer： 由于蛋白是两性的，与SDS结合会使蛋白带负电荷，使其在毛细管中往正极方向移动。 内参蛋白溶液：指示迁移时间的变化。 碘乙酰胺：与游离巯基反应，防止其攻击二硫键导致片段增多。,样品处理：,在1.5mL离心管中加入SDS-MW Sample Buffer 50L，内参蛋白溶液2L，碘乙酰胺溶液10L振荡混匀。取供试品溶液（2.5mg/L）40L，振荡混匀。将离心管置于70水浴加热10min，再次振荡混匀，室温冷却。3000rpm离心60s，取上清液90L至PCR管中。,CE-SDS(非还原）,2010版中国药典对仪器的一般要求：,毛细管：弹性石英毛细管，内径50m和75 m使用较多。根据分离度要求，可选用20cm-100cm长度。,CE-SDS(非还原）,直流高压电源：采用0-30kV（或相近）可调节直流电源，可供应约300 A电流。具有稳压和稳流两种方式可供选择。,冲洗进样系统：每次进样之前毛细管要用不同溶液冲洗。进样方式有压力进样，负压进样，虹吸进样和电动进样。通过控制压力或电压及时间来控制进样量。,检测系统：将毛细管接近出口端的外层聚合物剥去2mm一段，使石英壁裸露，毛细管一侧放置一个石英聚光球，使光源聚集在毛细管上，透过毛细管达到光电池。对无光吸收或荧光的溶质的检测，还可采用间接测定法，即在操作缓冲液中加入对光有吸收或荧光的添加剂，在溶质到达检测窗口时出现反方向的峰。,对电泳实验的影响因素, 缓冲液pH：pH能影响样品的解离能力，样品在极性强的介质中离解度增大，电泳速度也随之增大，从而影响分离选择性和分离灵敏度。,CE-SDS(非还原）, 分离电压：, 温度 ：温度影响分离重现性和分离效率。温度升高，缓冲液粘度 降低，分析时间减短，分析效率提高。但温度过高，会引起毛细管柱内 径向温差增大，焦耳热效应增强，柱效降低，分离效率也会降低。,SEC-HPLC,体积排阻色谱(SEC)是利用多孔凝胶固定相的独特特性，而产生的一种主要依据分子尺寸大小的差异来分离的液相色谱方法。,简介：,分离机理：,固定相是多孔性凝胶，大分子不能进入凝胶孔洞而完全被排阻，只能沿多孔凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱，首先被洗脱出来；中等大小的分子能进入凝胶中一些适当的孔洞中，但不能进入更小的微孔，在柱中受到滞留，较慢地被洗脱出来；小分子可进入凝胶中绝大部分孔洞，在柱中受到更强的滞留，会更慢地被洗脱出。,图示,仪器： 高效液相色谱仪需定期检定，周期为1年。,SEC-HPLC,2010版中国药典对仪器的一般要求和色谱条件,色谱柱： 多使用凝胶或亲水刚性、多孔微球、机械强度好的聚合物等填充物 使用水或缓冲盐作为流动相，流动相的pH值一般控制在28之间。 流速一般在0.51.0ml/min,检测器： 常用UV（紫外-可见）检测器，检测波长通常为280nm。,2019/8/21,13,可编辑,SEC-HPLC, 柱效率N：色谱柱的效率可借用“理论塔板数”N进行描述。, 分离度R：判断物质在色谱柱中的分离情况,常作为柱的总分离效能指标。,式中，tR1， tR2分别为对应于峰1和峰2的保留时间； W1，W2分别为峰1和峰2的峰底宽,色谱柱性能评价的两个重要参数,N=16(tR/W)2 =5.54(tR/W1/2)2,tR 为保留时间；W代表峰宽；W1/2 ：半高峰宽，通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离。,R=2(tR2-tR1)/(W1+W2),SEC-HPLC, 色谱柱填料的孔径大小及其粒径分布均匀性 孔径太小，待测物不易流出，分析时间长，展宽严重 。孔径太大则很可能导致组分分不开。在做凝胶色谱时，先大致估计下待分析物的分子量，然后选择合适的柱子，如果不知道粒径，可先用大孔径的先试试，接着再用小粒径的以达到更高的精度。, 流动相,凝胶色谱中流动相的影响不像别的色谱（如反相or离子色谱)那么明显。其中主要影响的是流动相的流速，一般流速越大，出峰越快，但分离效果可能不是很好。, 色谱柱高度和直径,色谱柱越长，样品组分分的越开，但过长时会消耗太多的溶剂，而且柱展宽等也容易变的严重。色谱柱直径太大时，样品沿径向的分布容易不均匀，容易出现柱中心处比柱四周跑的快，从而增加了展宽。,影响色谱分离因素,两种检测方法的结果评定,抗体结构,IgG,HL,HH,HHL,LC,HC,HMW (11.9%),HMW(7.4%),HMW （0.9%）,两种方法例证比较,SEC-HPLC,示例图如下,CE-SDS,DP(40，30天)_GB232-20121102 DP(40，20天)_GB232-20121102 DP(40，10天)_GB232-20121102 DP_GB232-20121102,HMW,LMW,总结：, 优势, 不足,分子尺寸相同的混合物（如同分异构体的混合物）不易分开。,优势与不足,操作简便快捷、数据可靠且重现性好、自动化程度高等。可应用于