课件：媒介生物的抗药性监测浙江省疾病预防控制中心任樟尧精.ppt

媒介生物的抗药性监测 浙江省疾病预防控制中心 任樟尧背 景,抗药性是影响全球公共卫生、农业、林业、畜牧业等领域中有害生物控制的重要问题，是影响媒介生物性传染病预防控制的关健因素。化学杀虫剂是防制卫生害虫的主要措施之一，在防治虫媒传染病中起到了非常重要的作用。但是，由于长期、广泛、大量的使用，导致病媒生物的抗药性不断增加，给除害灭病工作带来了新的课题。,开展和加强重要病媒生物的抗药性监测，可以指导化学杀虫剂的科学合理使用，提高控制效果，延缓抗药性发展的的速度，减少人畜中毒事件的发生，保护有益生物，维持生态平衡。,抗药性监测是害虫抗药治理的关健环节之一。准确、及时的获得抗药性的信息对于成功治理害虫抗药性、延长新药剂的使用寿命、改善环境具有重要的意义。,监测目的,掌握重要病媒生物对主要化学杀虫剂的抗性水平，了解抗性动态和发展规律。为病媒生物控制中化学杀虫剂的选择和使用提供科学依据；针对不同疫情、不同地区、不同病媒生物制定药剂的储备和使用预案。,为了进一步掌握我省病媒生物对常用杀虫剂的抗药性情况，选择城镇居室中常见蚊种之一的淡色/或致倦库蚊和家蝇，在省内不同地区开展抗药性监测研究。及时了解抗性动态，分析不同地区的抗药性现状和抗性水平以及同类杀虫剂在不同地区的使用效果，研究防制对策，巩固除害灭病成果等提供科学依据。,抗药性性监测技术的发展,害虫抗药性监测的基础是抗药性的检测技术，害虫抗药性监测是一个时间过程，监视害虫抗药性的时间动力学或评价抗药性治理的有效性。 抗药性监测技术主要分为3个层次，即种群水平、蛋白质水平、分子水平。,要 求,抗药性监测，以WHO推荐的测定方法为基础，统一方法（调查点的选择、采集方法、实验方法）、统一标准（死亡虫体的判定标准）、统一调查对象、统一药剂、统一调查时间。,监测内容和方法,靶标昆虫 淡色库蚊/致倦库蚊的幼虫和成虫、家蝇成虫监测对象。 监测点的选择 当地媒介生物性疾病的发生情况；相关疾病媒介生物的种类和发生的强度；病媒生物对人的骚扰程度等。 监测点要考虑地理要布，要相对固定。,监测时间,病媒生物在当地的发生高峰期（6-8月），一般同一个虫种每2年监测一次，不同监测年份测定时间相对固定。,试虫的采集,试虫的采集以居民区（城市或农村）及人活动频繁的区域（公园、绿化带、村庄周围500m内）为主。在其东、西、南、北、中5个方位采集样本，按接近等比例混合后进行抗药性测定。 抗药性测定，在采集试虫的当代或室内饲养的1-2代进行。 蚊虫的采集：成蚊、幼虫、卵块，采集方法及工具。 蝇的采集：成蝇，采集方法与工具。 蜚蠊的采集：采集方法与工具。,实验室的培育,1、饲养条件 饲养室面积一般不超过10-12m2，高度不高于2.5m，建筑结构应避免自然热、寒气候的影响。室内配备温控设备，干湿、温度计。 温度 25-28 相对湿度 家蝇、蟑螂50%-70%，蚊虫70%-80%。 光照 家蝇、蚊虫饲养室每日光照9h，蟑螂饲养用黑布遮盖。,2、饲养设备 饲养架 放饲养笼用，高2m（可隔3-4层，每层高45-50cm），宽40cm，长2m。饲养架靠墙边侧每层装有30w日光灯，昆虫饲养照光用。,饲养笼 成蝇饲养笼 有铅丝架和绢纱笼二部份组成。铅丝架：由8号或10号铅丝为骨架，铅丝架的背侧二边装有二根活动的铅丝钩，用作固定骨架用，卸掉二根铅丝钩，架子可活动折叠。铅丝架底部为20号铅丝织成网眼形。铅丝架是边长25cm的四方形。绢纱笼：用绢纱布做成23cm的四方形笼子，绢纱笼四角接15-20cm长的线带，便于吊扎在铅丝笼架上。绢纱笼前下方开一长20cm、宽20cm、高20cm的正方形开口，连接15cm的长袖，取放幼虫缸和更换饲料。 幼虫缸、卵杯、平皿、绢纱布等。,蚊虫饲养笼 四边为木框架制成，大小为长40cm宽25cm高25cm。上面按装活动玻璃，四周为铜纱网、底部为木质板，在笼的前端正中开一直径15cm圆孔，连接长30cm的布袖，便于取放蚊虫和饲血动物。,蟑螂饲养缸 为玻璃缸、不锈缸圆桶、有机玻璃箱，上部四周边缘均匀涂抹凡士林油脂，以防蟑螂逃逸。内设隐藏架子，规格视情况而定，缸口用纱布作盖。 产卵及孵化 其它器材 饲料盘、50-100ml烧杯、500ml烧杯、搪瓷盆、水桶、药匙、棉花、捞勺等。,3饲养方法,家蝇饲养 成蝇：羽化后的成蝇移入饲养笼内，同时放入饲料盘和吮水槽。盘内饲料是用白糖和奶粉1：1比例投放。吮水槽可用50-100ml烧杯，杯内装满脱氯水，水面上放一塑料泡沫片，以便蝇吮水停落。饲料和水应及时更换，如变质，蝇吃后易死亡。成蝇羽化后72小时就会产卵，此时应放入盛有麦麸的产卵槽，其配比是麦麸1份和水2份。产卵槽必须每天检查，如没有产卵的应重新更换麦麸。已经产卵的应及时取出卵槽待孵出一令幼虫移入幼虫缸。,幼虫期：幼虫接种入幼虫缸后（幼虫缸可用500ml烧杯），用绢纱布盖住，橡皮筋箍紧，以防幼虫爬出。每只幼虫缸接种幼虫约500条。幼虫缸饲料配比：麦麸100g，奶粉5g，水200ml（一份饲料饲喂幼虫500条左右）。配比方法：先将奶粉溶化在水中，然后加入麦麸拌匀，水量视麦麸质量可适当调配（麦麸粗吸水少，麦麸细吸水多），其干湿程度以手抓调匀的麦麸轻握拳，饲料内的水分沿指缝渗出而不流滴，松拳后饲料不散落为宜。,蛹期：三令幼虫成熟后（约一周），返回饲料缸表面化蛹。化蛹时，幼虫先缩成团，24小时后，变红褐色蛹，后再变成黑褐色。蛹期5天左右开始羽化，移入饲养笼内饲养。,蚊虫饲养 成蚊饲养 通常用蚊笼饲养，每笼可养成蚊500只左右。笼内放入用5%葡萄糖液浸透的脱脂棉一小杯作为饲料，每1-2天更换一次。成蚊在羽化后3-5天多数已完成交配，此时即需供雌蚊吸血。供血时，用体重25g左右的小白鼠，使其腹部向上固定在铁板架上，剪去腹毛，放入笼内喂血12小时。雌蚊吸血后，在25-28下约3-4天产卵。此时在笼内放入清水一杯，供产卵用。每日在水杯中取出卵块，移入幼虫饲养盆的水中。,幼虫饲养 饲养幼虫的搪瓷盆应经常保持清洁，固定专用。每只幼虫饲养盆放入幼虫约1500-2000条。饲养用的自来水，必须隔夜脱氯。幼虫饲料用面粉2份，肝粉1份的混合饲料。以揉松的毛笔蘸取少许混合饲料均匀撒布于水面，每日加饲料1-2次。以不使饲料过剩为度。幼虫经7-10天开始化蛹，化蛹后，用吸管将蛹移入含水约50ml的杯内，将蛹杯置蚊笼内，经2-3天即羽化成蚊。,蟑螂饲养 成虫及若虫的饲养 成虫及若虫按不同龄期分别于饲养缸内进行饲养。缸内放入2个玻璃平皿，其中1个盛饲料，另1个盛含水的脱脂棉，第2天更换1次，饲料可用饼干，饲养缸内可放若干硬纸盒，供蟑螂栖息活动。,产卵及孵化 将快要产卵的雌虫移入产卵孵化器的小盘内，同时放入盛有饲料及饮水的平皿和14目电镀铁纱卷各1个，供雌虫食料和栖息产卵之用。每日观察1次，将已产完卵的雌虫取出再放入另一些将产卵的雌虫。同时更换大盘内供若虫栖息的纸卷，将其中的若虫移入饲养缸内单独饲养。,注意事项 1 饲养室必须保持整洁。 2 饲养室饲料要防止霉菌污染。 3 饲养室必须密封，严防试虫交叉、外逃。 4 严禁药物、接触过药物的器材放入饲养室和在饲养室周围喷洒药物。,监测药剂,淡色/致倦库蚊的监测药剂 拟除虫菊酯类：高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、氯菊酯；有机磷类：敌敌畏、倍硫磷、双硫磷、杀螟硫磷；氨基甲酸酯类：仲丁威；有机氯类：DDT、三氯杀虫酯。,家蝇的监测药剂 拟除虫菊酯类：高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、氯菊酯；有机磷类：敌敌畏、毒死蜱、甲基吡恶磷；氨基甲酸酯类：残杀威；有机氯类：DDT。 溶剂：以丙酮（分析纯）作溶剂。,2019/8/25,27,可编辑,抗药性测定参考浓度：,淡色/致倦库蚊自然品系抗药性测定（LC50）的参考浓度：DDT1.1 mg/L、三氯杀虫酯0.50mg/L、敌敌畏0.750mg/L、仲丁威0.75mg/L、二氯苯醚菊酯0.02mg/L、溴氰菊酯0.0010mg/L、右旋丙稀菊酯0.15mg/L、高效氯氰菊酯0.010。,家蝇自然品系抗药性测定（LD50）参考浓度：胺菊酯1.150g /只、三氯杀虫酯5.50g/只、敌敌畏为0.70g/只、仲丁威0.75g /只、二氯苯醚菊酯0.060g/只、溴氰菊酯0.025g /只、右旋丙稀菊酯0.450g /只、高效氯氰菊酯0.075g/只。,测定方法,蚊幼虫的抗药性测定 蚊幼虫的测定：采用药液浸渍法（WHO推荐方法），以4龄初期幼虫为测试对象，测定半数致死浓度（LC50）。 器具：50ml、500ml容器，1ml、5ml刻度移液管。 环境条件：温、湿度 试虫：正常品系、自然品系、龄期等,浓度的设定：根据上述提供的半数致死浓度参考数据，各测试单位在正式测试前，需进行一次预测，根据预测结果，按等差或等倍设定实验所需浓度（设置5-7个系列浓度）。,测定步骤： 取50ml容器若干只，先放入适量的脱氯水（45ml左右），用吸管吸取四龄期幼虫20-25条，放入幼虫后，用脱氯水补至50ml。 取250-500ml容器若干只，先在每只容器的边缘粘贴一小块胶布，注明测试药物名称和浓度值。,在每只容器内加脱氯水150ml。然后根据设定的不同浓度的丙酮药液，用刻度移液管吸取药液分别加入容器内，用玻璃棒从低浓度向高浓度逐一搅拌均匀，把50ml容器内的幼虫轻轻地分别倒入500ml容器内，合计成200ml水溶液，设以200ml脱氯水和加入与药液等量的丙酮液作对照，在实验室相应条件下，放置24h。24h后检查记录各系列浓度的幼虫死亡数。同一个测试浓度重复4-5次，供试虫数共计100条。,死亡判断标准：检查死亡数时，可用尖头镊子或昆虫针轻轻触动幼虫头部和尾部，不动者为死亡，只是震颤也视为死亡。如果有化蛹的应该剔除，若化蛹率超过10%，对照组死亡率超过20%以上者，试验视为无效，整个实验应重做。 结果处理：将测试所获得的结果汇总整理后，计算LC50。,成蚊的测定 成蚊抗药性测定方法主要有两种，分为滤纸圆筒接触法和微量点滴法。 滤纸圆筒接触法：这是一种常用的测定方法，是WHO推荐的标准方法之一。 器具：由两个筒联成一套，一个为接触药纸用，另一个为蚊虫接触药纸后作恢复饲养用。接触筒用有机玻璃制成，筒长12.5cm，直经5cm，一端用尼龙纱封口，另一端有螺纹。另有一白色不透明的有机玻璃方隔板，77cm，中间有一直经5cm的圆孔和高1cm的边圈（有内螺纹），每隔板内装活动抽板一块，抽板有直经3.5cm的圆孔，拉动抽板可使隔板两侧的圆筒封闭或打通，每两圆筒易于装上或取下联成一套。,药纸的制备：将白油和乙醚按1:2比例混合作为溶剂。杀虫剂按需要量溶解其中，配成一定浓度，吸取2.14ml均匀滴于16cm12.5cm的新华1号滤纸或其他质量相近的滤纸上。2h后后待乙醚完全挥发即可应用。 药纸制备后应在6h内使用，如需要保存可将药纸装入黑色的袋中，在较低温度下保存，但一经开启后即不能储存，必须在2-3天内用完，如果已经装入接触，就只能用一次。,测试时先把恢复筒安装在隔板的一面，用吸蚊器吸取20-25只雌蚊（羽化后约2-3天，未吸血）吹入筒内，然后关闭隔板，在隔板另一面装上已衬贴药纸的接触筒，把隔板拉开，将恢复筒内蚊虫轻轻吹入接触筒，迅速关上隔板，将筒放平，开始计算接触时间，接触1h。完毕后再抽开隔板将蚊虫吹入恢复筒，关上隔板，将筒直放，用浸有5%葡萄糖水的棉花球置于尼龙网上。观察24h试虫死亡数，重复4-5次，每剂量应至少测100只蚊虫。,点滴法的要求： 1、试虫的均性；2、剂量的选项择及配制（预测3个浓度，共设置5-7个浓度）；3、试虫来源；4、麻醉；5、点滴（剂量准确、部位准确、性别准确）6、观察；7、死亡率等。,成蚊的微量点滴法： 操作较精确并要求高，是研究抗性机制的重要方法之一。 器具：旋转式微量点滴器或自制玻璃毛细管点滴器、小型养蚊笼等。 溶剂：分析纯丙酮。当固体杀虫剂如浓度过高（如超过1%）时，容易在点滴器针头及虫体表面上结晶，在丙酮内加入5%橄榄油，可防止这种现象。 药液配制：每一次测定设4-5个系列浓度，一般情况下药液浓度均较低，最高浓度不超过0.5%。测定结果以每蚊受药量计算（l/蚊），按每个剂量的死亡率求出LD50和LD95。,试虫来源：应在试验前夜捕捉刚吸血蚊虫携回室内至次日上午做测定试验，此时胃血已开始消化。如果蚊虫专嗜人血的，于当日早晨在室内捕捉已吸血的蚊虫，或者于夜间捕捉飞入人室的雌蚊，在笼内饲以动物血，待胃血消化至谢拉氏3-4期时测定。,操作程序：把上述吸血雌蚊用乙醚麻醉，每20头仰卧排列在一玻璃器皿上，用药液点于胸部的腹面，每虫受药量一般为0.3-0.5l，滴药后把蚊虫迅速移入小型养蚊笼内恢复，给以正常饲养，24h后检查死亡数。每剂量重复1-2次，环境条件与正常饲养类同。,家蝇的抗药性监定 微量点滴法：全国家蝇抗性协作组统一推荐方法。 器具：点滴器采用10l、20l微量进样器，小型养蝇笼等。 药剂：先将杀剂原药用丙酮（分析纯）稀释成1%母液（可根据实际需要），然后按等差或等倍配制成5-7个系列浓度，放置于冰箱内备用（使用玻璃溶器，时间不过长）。,取3-7日龄家蝇雌性成虫，体重为18-20mg/只。经乙醚轻度麻醉后，选取健康雌虫50只，放置于平皿中，背部向上，然后用点滴器将药液按以上设置的系列浓度由低到高的顺序，点滴于中胸背板上（0.5-1l），点滴完毕把试虫放入小型养蝇笼内（亦可用500ml洁净的烧杯替代），放入少量的奶粉和海绵或脱脂棉球供水，饲养24h，观察死亡数，用丙酮液替代药液作空白对照。每个系列浓度点滴家蝇50只，试验重复二次。,死亡判断和结果处理：凡腹部上翻，六足抽搐，用可用尖头镊子或昆虫针轻轻触之不能翻动5爬行者判为死亡。当死亡率超过20%时，整个试验需要重新进行。将测试所获得的结果汇总整理后，计算LD50。,蜚蠊抗性监测 三角烧瓶药膜法、点滴法 器具：500ml三角烧瓶、磨口瓶、10l和100l微量进样器、饲养笼等。 药剂：先将杀剂原药用丙酮（分析纯）稀释成1%母液（可根据实际需要），然后然后进一步稀释成0.05%的涂膜液盛于磨口瓶内，注明标签，放置于冰箱内备用（使用玻璃溶器，时间不过长）。 试虫：采集于调查点的当地优势种，如德国小蠊、美洲大蠊、黑胸大蠊等，携回实验室正常饲养3-5天后备用。,三角烧瓶药膜法： 药膜瓶的制备：取洁净的三角烧瓶1只，用移液管吸取