课件：生化蛋白质.ppt

1,第二章 蛋白质,2,1 概述,3,蛋白质的元素组成,C：50%-55%,H：6%-8%,O：20%-23%,S：0%-4%,N：15%-18%,微量元素：P、Fe、Zn、Cu、I 等,4,蛋白质平均含N量为16,这是凯氏定氮法测蛋白质含量的理论依据： 蛋白质含量蛋白质含N量6.25,5,蛋白质的分类,6,2 氨基酸的理化性质,7,分子中既有氨基又有羧基的化合物。,2.1 氨基酸的结构,-氨基酸通式,8,(1)按R基的化学结构分： 脂肪族氨基酸：中性氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；含羟基或硫氨基酸：丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸；酸性氨基酸及其酰胺：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；碱性氨基酸：赖氨酸、精氨酸； 芳香族氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸； 杂环族氨基酸：组氨酸、脯氨酸。,2.2 氨基酸的分类,甘氨酸 （Gly,G）,丙氨酸 （Ala,A）,缬氨酸 （Val,V）,亮氨酸 （Lue,L）,异亮氨酸 （Ile,I）,中性脂肪族氨基酸,含羟基或硫脂肪族氨基酸,丝氨酸 （Ser,S）,苏氨酸 （Thr,T）,甲硫氨酸 （Met,M）,酸性氨基酸及酰胺,天冬氨酸 （Asp,D）,谷氨酸 （Glu,E）,天冬酰胺 （Asn,N）,谷氨酰胺 （Gln,Q）,赖氨酸 （Lys,K）,精氨酸 （Arg,R）,碱性氨基酸,芳香族氨基酸,苯丙氨酸 （Phe,F）,酪氨酸 （Tyr,Y）,色氨酸 （Trg,W）,杂环族氨基酸,14,(2)按R基的极性分：,非极性氨基酸：Ala，Ile，Leu，Phe，Met，Trp，Val，Pro,极性氨基酸,无电荷侧链氨基酸：Ser，Thr，Tyr，Asn，Gln，Cys，Gly 带正电荷侧链氨基酸：Lys，Arg，His 带负电荷侧链氨基酸：Asp，Glu,15,2.3 氨基酸的两性解离及等电点,氨基酸在水溶液或晶体状态时存在形式,不是,两性离子(偶极离子),16,H2N CH COO- H3N+ CH COO-,R,R,H3N+ CH COOH,R,负离子,两性离子,正离子,氨基酸分子在不同pH水溶液中的存在状态：,17,氨基酸的等电点pI,调节氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的NH3+和COO-解离度相等，即氨基酸所带的净电荷为零，在电场中，不向任何一极移动，此时溶液的pH叫做氨基酸的等电点pI。,18,R,H3N+ CH COO- H3N+ CH COOH,R,R,pH pI,pH pI,R,H3N+ CH COO- H2N CH COO- + H+,酸性溶液,碱性溶液,向阴极移动,向阳极移动,19,氨基酸等电点的计算,可见，氨基酸的pI值等于该氨基酸的两性离子状态两侧的基团pK值之和的二分之一。,20,与茚三酮反应,与甲醛反应：无法直接使用酸碱滴定。加入甲醛以后，可以使用NaOH滴定，并用酚酞做指示剂。,2.4 氨基酸的化学反应,蓝紫色物质,脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮生成黄色物质,21,与2,4-二硝基氟苯(DNFB)反应：氨基酸的-氨基与DNFB反应，生成黄色物质，可用来鉴定多肽或蛋白质的N端氨基酸的种类和数目。,22,* 反应特点 A.为- NH2的反应 B.氨基酸- NH2的一个H原子可被烃基取代(卤代烃) C.在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成二硝基苯氨基酸,23,替代：5-二甲氨基萘磺酰氯(DNS-Cl),氨基酸与丹磺酰氯(DNS-Cl)反应，生成荧光物。,24,与异硫氰酸苯酯(PITC)反应：氨基酸的-氨基与PITC反应，生成苯硫乙内酰脲(PTH)氨基酸。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,25,与荧光胺反应：室温下，氨基酸可与荧光胺反应，生成荧光物质，通过荧光分光光度计可测定氨基酸含量。,26,3 蛋白质的结构,27,3.1 概述,28,一级结构,二级结构,三级结构,四级结构,蛋白质结构体系,29,二级结构 超二级结构 结构域 三级结构 四级结构,高级结构 （构象）,一级结构,蛋白质结构体系,30,3.2 蛋白质的一级结构,是指氨基酸通过共价键即肽键连接而成的线性序列。 并包括肽链以外的其他成分以及这些非肽链部分的连接方式和位点。,31,+,肽 氨基酸的线性聚合物，也称为肽链。,肽键 (酰胺键),32,主链,NCC CCN,33,肽键不同于C-N单键和C=N双键； 肽键具有部分单键性质同时又有双键性质； 肽键不能自由旋转； C多处于反式构型。,肽单位结特征,34,1,2,3,4,5,6,肽平面 (酰胺平面),35,R基团对二个酰胺平面旋转具有阻碍作用,C=O与N-H基之间形成氢键阻碍酰胺平面的旋转,36,两个肽平面之 间不能任意转动,+,-,37,肽键的顺反异构体,38,蛋白质中多肽链一个片段的结构通式,NH2末端，(N端)，书写时放在左边，用“H”表示。,COOH末端，(C端)，书写时放右边，用“OH”表示。,命名时：从N端开始，连续读出氨基酸名称即可，除C端氨基酸外，其他氨基酸名称中“酸”改为“酰”,39,活性肽,（1）谷胱甘肽：由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，简称GSH。分子中有一个-肽键，同时含有活泼的巯基； （2）催产素和升压素（抗利尿激素）； （3）促肾上腺皮质激素（ACTH）； （4）脑肽：镇痛效果强于吗啡； （5）胰高血糖素； （6）胆囊收缩素；,40,是指由多肽链上主链骨架中各个肽段所形成的周期性的，由氢键维持的局部空间构象。,3.3 蛋白质的二级结构,41,（1）-螺旋 是指多肽链主链骨架围绕一个轴一圈一圈地上升，从而形成螺旋式的构象。,42,特征： 每一圈包含3.6个残基，螺距0.54nm，螺旋直径0.6nm； 每个肽基的C=O与前面第四个肽基的N-H形成链内氢键； 氢键的取向与螺轴几乎平行,3.613螺旋,43,侧链R对 -螺旋的影响,在多肽链上，连续存在带相同电荷基团的AA残基，则-螺旋不稳定 当Gly残基在多肽链上连续存在时，则影响-螺旋形成 Pro残基和羟脯氨基酸残基存在时，则不能形成-螺旋结构,44,（2）-折叠,是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的扇面状片层构象。,黑色表示C原子，蓝色表示N原子，红色表示O原子，白色表示H原子，黄色表示R基。,45,平行-折叠,反平行-折叠,46,（3）-转角（-回折、-弯曲、发夹结构）,由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成。 主链骨架以180返回折叠。 每个肽基的C=O与前面第四个肽基的N-H形成链内氢键。,47,没有规律的多肽链主链骨架构象。 无固定的走向，但也不是任意变动的 球状蛋白中含量较高，对外界理化因子敏感，与生物活性有关。 酶的活性部位,（4）无规卷曲,48,从结构的稳定性上看： -螺旋-折叠 -转角无规卷曲； 从功能上看正好相反，酶与蛋白质的活性中心通常由无规卷曲充当，-螺旋和-折叠一般只起支持作用。,49,3.4 超二级结构和结构域 超二级结构：由二级结构的基本单位相互聚集，形成有规律的二级结构的聚集体。 结构域：多肽链在超二级结构基础上进一步盘旋折叠成的紧密结构。,50,几种超二级结构,51,指含二级结构、超二级结构和结构域的蛋白质，是线性多肽链进一步折叠成为紧密结构时的三维空间排列。,概念,3.5 蛋白质的三级结构,疏水作用力,52,卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域,-螺旋,-转角,-折叠,二硫键,结构域1,结构域2,53,肌红蛋白的三级结构,54,肌红蛋白(myoglobin)分子由一条多肽链(153个残基)和一个血红素组成。分子呈扁圆形，大小为4.5nm3.5nm2.5nm。多肽链主链骨架包含长短不等的A、B、C、D、E、F、G、H 共8个-螺旋。分子中几乎80的氨基酸残基都是位于-螺旋结构中。-螺旋之间的拐弯处(AB、CD、EF、FG、GH)是无规卷曲。绝大多数亲水性R侧链分布在分子的外表面，与水分子结合，使肌红蛋白可溶于水溶液中。绝大多数疏水性R侧链埋藏在分子内部。,55,分子表面有一个深陷的空穴。该空穴由C、E、F、G 共4个螺旋段构成。空穴周围分布许多疏水性R侧链，从而为洞穴构成了疏水性环境。平面的血红素分子埋人疏水的洞穴中。维持肌红蛋白分子二级结构的力是范德华引力、疏水键、氢键和配位键。,56,云扁豆蛋白(A)和-乳球蛋白(B)的三级结构 图中箭头表示-折叠结构，圆柱体表示-螺旋,57,3.6 蛋白质的四级结构,四级结构：2个或2个以上具有三级结构的亚单位(亚基)，通过非共价键聚合而成的特定的构象以及亚单位的种类和数量。 亚基：一般是一条肽链，四级结构必须含有2条或2条以上肽链。,58,血红蛋白的四级结构,59,蛋白聚集成四级结构具有下列优势,增强结构稳定性； 提高遗传经济性和效率； 使催化基团汇集在一起，提高催化效率。寡聚酶 具有协同性和别构效应。,60,过程 多肽链 二级结构(-螺旋、-折叠、-转角、无规则卷曲等) 超二级结构 结构域 三级结构四级结构,61,一级结构,四级结构,二级结构,三级结构,62,蛋白质分子内固有的作用力, 所产生的分子内相互作用(即范德华相互作用和空间相互作用)； 周围溶剂影响所产生的分子内相互作用（包括氢健、静电和疏水相互作用）。,3.7 稳定蛋白质空间结构的作用力,63,蛋白质分子中的共价键与次级键,64,蛋白质的空间作用力,2019/8/30,65,可编辑,66,（1）空间张力,氨基酸残基的R基侧链的空间位阻限制键的自由旋转。,（2）范德华力,主要包括偶极-偶极作用力、偶极-诱导偶极相互作用力和色散力 。,67,（3）氢键相互作用,肽基团之间的氢键 非离子化羧基之间的氢键 酚或羟基与肽的羧基之间的氢键 侧链酰胺基之间的氢键,68,（4）静电相互作用,是由蛋白质氨基酸中可解离侧链基团引起的 ，一般蛋白质的静电相互作用能在3.5460KJ/mol范围。,（5）疏水相互作用,在蛋白质三级结构的形成和稳定中，疏水作用是位于诸多因素的首位。,69,（6）二硫键,限制蛋白质结构的数目 维持蛋白质结构的完整性 有利于所形成的结构保持稳定。,70,某些金属(Fe、Ca、Zn、Cu、Mn)可与蛋白质中的基团形成配位键，提高蛋白质的稳定性，并使一些蛋白质具有特殊生物活性。,（7）配位键,71,血红蛋白,高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质，是使血液呈红色的蛋白。 血红蛋白由四条链组成，两条链和两条链，每一条链有一个包含一个铁原子的环状血红素。氧气结合在铁原子上，被血液运输。,72,一级结构：蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序和连接方式。 二级结构：多肽链主链中各个肽段形成的规则的或无规则的构象。主要有-螺旋、折叠、-转角、无规卷曲。 超二级结构：由两个以上二级结构单元相互聚集形成的有规则的二级结构的组合体如、。,73,结构域：在二级或超二级结构的基础上通过多次折叠，在空间上形成一些半独立的紧密球状结构，叫结构域，它是三级结构的一部分，结构域之间靠无规卷曲连接。一般由100-200个氨基酸残基构成。 三级结构：在二级结构基础上，多肽链通过盘旋、折叠，形成紧密的球状构象。亚基或亚单位。 四级结构：亚基通过非共价键形成的聚合体的结构。,74,4 蛋白质结构与功能的关系,75,蛋白质的一级结构决定其高级结构 种属差异:在进化过程中，同源蛋白质序列的相似性大小反映蛋白质之间的进化关系的远近。,4.1 蛋白质一级结构和功能的关系,76,细胞色素c的一级结构与生物进化的关系,77,患者的Hb量仅为正常人（1516g/100m1）的一半，红细胞不仅数量少而且异常，除有大量的未成熟红细胞外，还有很多长而薄、新月状或镰刀状的红细胞，其携带氧的功能只有正常红细胞的一半。,分子病:镰刀形贫血病,正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图,镰刀形红细胞,正常红细胞,79,氨基酸序列的细微变化 正常的血红蛋白分子和异常的血红蛋白分子仅在链的第6个氨基酸由谷氨酸Glu变为了缬氨酸Val。,-链N端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人） Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患 者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys,80,4.2 蛋白质的空间结构与功能的关系,别构现象： 某些蛋白质表现其生物功能时，构象发生改变，从而改变了整个分子的性质，这种现象称为别构效应。,81,5 蛋白质的性质,82,5.1 蛋白质的相对分子质量,沉降系数S,83,5.2 蛋白质两性解离性质和等电点,蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点(pI)。,84,pI是蛋白质的一个特征常数。 蛋白质在等电点时的溶解度最小，因此可以利用蛋白质等电点的不同来沉淀不同的蛋白质，分离蛋白质混合物。,85,5.3 蛋白质的变性,概念 由于外界因素的作用，使天然蛋白质分子的构象发生了异常变化，从而导致生物活性的丧失以及物理、化学性质的异常变化，不包括一级结构上肽键的断裂。,86,可逆变性： 除去变性因素之后，在适当的条件下蛋白质构象可以由变性态恢复到天然态。 不可逆变性： 除去变性因素之后，在适当的条件下蛋白质构象由变性态不能恢复到天然态。,87,蛋白质变性现象,88,引起蛋白质变性的因素,物理因素 温度、紫外线、X射线、超声波、高压、表面张力，以及剧烈的振荡、研磨、搅拌等； 化学因素 又称变性剂，包括：酸、碱、有机溶剂（如乙醇、丙酮等）、尿素、盐酸胍、重金属盐、三氯醋酸、苦味酸、磷钨酸、去污剂等。,89,5.4 蛋白质的胶体性质,由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的颗粒，因而具有胶体溶液的特征。 蛋白质溶液稳定的原因： (1)表面形成水化膜； (2)表面带相同电荷。,90,5.5 蛋白质的沉淀反应,如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态、失去水化层或消除相同电荷，蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。,91,(1) 盐析法,在蛋白质溶液中加入高浓度的硫酸铵、氯化钠等中性盐，从而使蛋白质颗粒聚集而生成沉淀，这种现象称为盐析。 分段盐析： 不同蛋白质分子的水膜厚度和带电量不同，发生盐析所需要的盐浓度不同。改变盐浓度可分离蛋白质混合物，这被称为分段盐析法。,92,(2) 有机溶剂沉淀法,加入极性的有机溶剂如甲醇等，脱去水化层并增加质点间的相互作用而沉淀。 改变有机溶剂的种类和浓度，可分离蛋白质混合物，这被称为有机溶剂分级法。,(3) 重金属盐沉淀法,当pH大于等电点时，蛋白质颗粒带净负电荷，易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。 在临床上，利用这种特性抢救重金盐中毒的病人和家畜。,93,(4) 生物碱试剂或酸类沉淀法,当pH小于等电点时，蛋白质颗粒带净正电荷，易与生物碱或酸根负离子结合成不溶性盐而沉淀。 临床化验时，常用上述生物碱试剂除去血浆中干扰测定的蛋白质。,(5)加热变性沉淀法,蛋白质因加热变性而凝固。 烹调中蛋白质加热变性，更有助于消化吸收。,94,长期摄入生鸡蛋可引起生物素缺乏,生鸡蛋中含有抗生物素蛋白，且含量高于全蛋生物素含量，抗生物素蛋白可以与生物素牢固结合，使得难以消化，鸡蛋经烹调加热处理后抗生素蛋白即遭破坏。 鸡蛋蛋壳表面甚至蛋黄被细菌污染沙门氏菌，引起食物中毒，加热可杀死。,95,5.6 蛋白质的颜色反应,96,6 蛋白质的分离纯化,97,6.1 利用溶解度差别的纯化方法,(1) 等电点沉淀和pH控制 蛋白质处于等电点时，溶解度最低。 在等电点以上或以下的pH时，蛋白质分子携带同种电荷而相互排斥，阻止了分子聚集沉淀，因此溶解度较大。,98,(2) 蛋白质的盐溶和盐析 盐溶：在蛋白质水溶液中加少量中性盐，增加分子表面电荷，增强分子与水的作用，使蛋白质在水溶液中的溶解度增大的现象。 盐析：在高浓度的盐中，离子将蛋白质水化膜的水夺去，使蛋白质发生沉淀的现象。如饱和硫酸铵。,99,(3) 有机溶剂分级分离法 有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因是改变了介质的介电常数。水是高介电常数物质(20时，80)，有机溶剂是低介电常数物质(20时，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4)，因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。,100,(4) 温度 在040之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但人的血红蛋白从025，溶解度随温度上升而降低。 在4050以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，在中性pH介质中失去溶解力。 大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在0或更低的温度下进行。,101,6.2 根据分子大小不同的纯化方法,(1) 透析和超过滤 透析：利用蛋白质分子不能通过半透膜，使蛋白质和其他小分子物质分开的方法。 半透膜：玻璃纸、火棉纸和其他改型的纤维素材料。,102,透析法：利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。这种方法称为透析。,103,超过滤：透析时对半透膜加压，一般液体与膜表面相切的方向流动，使部分液体透过膜，另一部分液体切向流过膜表面，将膜截留的蛋白质分子冲走（反流回样品槽），避免在滤膜表面堆积塞。样品含量低时因吸附不能回收而采用此法。,104,(2) 凝胶过滤 又称凝胶过滤层析、分子排阻层析、凝胶渗透层析。这是按大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一。 常用的凝胶有交联葡聚糖，聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖等。,105,小分子进入凝胶分子内，被滞留,大分子在凝胶颗粒间移动，较快流出,溶剂流动方向,按分子量从大到小依次流出,106,6.3 根据电荷不同的纯化方法,(1) 电泳法 在电场作用下，带电颗粒向与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。相同pH下，分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率不同，在电泳时可以分开。 自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。 区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。,107, 纸上电泳：用滤纸作支持物； 凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。 圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。 平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。,108,109,(2) 离子交换层析 利用不同的蛋白质分子在溶液中所带电荷不同，因而与离子交换树脂有不同之吸附力，随后改变溶液的pH值或离子强度，结合力最小的蛋白质先洗脱下来。,110,6.4 根据配体特异性进行分离,(1) 亲和层析 配基：能被生物大分子识别并与之结合的原子、原子团和分子。 利用蛋白质对其配体分子特有的识别能力，即生物学亲和力建立起来的分离纯化方法。 凝集素亲和层析、免疫亲和层析、金属螯合层析、染料配体层析和共价层析等都属于亲和层析类,111,抗体和抗原的结合：高度特异性,把抗体作为“鱼饵”(配体)，分离抗原。,112,亲和层析的操作机理,固相载体,(1),(2),(3),样品,洗脱,洗脱,113,6.5 蛋白质分子中氨基酸序列的测定,测定蛋白质的分子质量和多肽链的数目 拆开蛋白质分子的多肽链 断开多肽链内的二硫键 分析每一条多肽链的氨基酸组成 鉴定多肽链的N末端和C末端残基 把多肽链裂解成两组以上大小不等的较小片段 测定各肽段的氨基酸序列 重叠各肽段，重建完整多肽链的一级结构顺序 确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置,114,7 蛋白质的测定,115,蛋白质定量法,利用蛋白质共性的方法,定氮法 双缩脲法 物理法,利用特定氨基酸残基法,染料结合法 福林酚试剂法,116,凯氏定氮法,原理 消化,样品中含氮有机化合物经浓硫酸加消化，硫酸使有机物脱水；同时有机物炭化生成炭； 碳将硫酸还原为SO2，C则变为CO2； SO2使氮还原为氨，本