4蛋白质

生 物 化 学,第四章 蛋白质化学,第四章 蛋白质化学,学习要求,氨基酸,肽,蛋白质的分子结构,蛋白质的分子构象,蛋白质的重要作用,蛋白质的结构与功能,蛋白质的性质及纯化,学习要求,了解蛋白质生物功能、分类,2. 了解氨基酸分类、结构、重要化学反应和分离、分析方法，重点弄清楚它的两性性质, pI 和 Pk,4. 了解蛋白质的重要理化性质,3. 弄清楚蛋白质的一级结构及其序列分析方法。了解二、三和四级结构基本概念,5. 了解蛋白质分离、纯化方法及其理论依据,6. 有哪些结合蛋白？它们的分布、特性和生物功能质,返回,2019/9/15,蛋白质的重要作用,蛋白质组成与分类,蛋白质在生命过程中的重要作用,2019/9/15,蛋白质的重要作用,蛋白质作为生命现象的物质基础之一，构成一切细胞和组织结构的最重要的组成成分，参与生物体内许多方面的重要功能,2019/9/15,蛋白质的重要作用,（一）酶的催化作用 （二）转运和贮存功能 （三）运动功能 （四）结构支持作用 （五）免疫作用 （六）生物膜功能,2019/9/15,（七）接受和传递信息 （八）代谢调节功能 （九）控制生长和分化 （十）感染和毒性作用 （十一）其他作用,蛋白质的重要作用,返回,2019/9/15,蛋白质组成与分类,组成基本单位,主要组成元素为碳、氢、氧、氮，有的还含有硫、磷、碘或金属元素（如铁、铜、锌等）；这些元素在蛋白质中的元素组成百分比约为：,碳 50 氢 7 氧 23 氮 16%（特征性元素,蛋白质含量含氮量6.25） 硫 04 其他 微量（P、Fe3、Cu2、Zn2、Mn2等）,氨基酸,2019/9/15,蛋白质的常见分类方法,1根据蛋白质的化学组成 2根据蛋白质的溶解性和组成 3根据蛋白质分子形状 4根据蛋白质生物功能,简单蛋白质和结合蛋白质,分类表,球状蛋白质和纤维状蛋白质,活性蛋白质和非活性蛋白质,返回,返回,氨基酸,氨基酸的结构与分类 氨基酸的理化性质 氨基酸的分离与分析 氨基酸的制备和应用状况,氨基酸的结构,蛋白质是由二十种基本氨基酸组成的,氨基酸结构通式:,氨基酸的结构,-氨基酸有两种构型:D构型和L构型 它们是与甘油醛或乳酸相比较而决定的。凡是与L甘油醛（或L乳酸）构型相同的，就定义为L氨基酸，反之为D氨基酸 蛋白质水解得到的氨基酸都是L-型氨基酸， 且L-型氨基酸大多具右旋性，少数左旋性,氨基酸的结构,1、根据氨基酸R基侧链的极性， 可将氨基酸分为,疏水性氨基酸（非极性氨基酸）,亲水性氨基酸（极性氨基酸）,氨基酸的分类,不带电荷的极性氨基酸,带正电荷的碱性氨基酸,带负电荷的酸性氨基酸,Asp Glu,Lys Arg His,Ser Thr Tyr Asn Gln Cys Gly,Ala Val Ile Leu Pro Met Phe Try,2、根据酸碱性分,酸性氨基酸,碱性氨基酸,中性氨基酸,Lys Arg His,Asp Glu,Ala Val Ile Leu Pro Met Phe Try Ser Thr Tyr Asn Gln Cys Gly,3、根据R的化学结构分,芳香族氨基酸,杂环氨基酸,杂环亚氨基酸,His,Phe Tyr Try,Pro,脂肪族氨基酸,Ala Val Ile Leu Met Ser Thr Asn Gln Cys Gly Asp Glu Lys Arg,4、根据营养价值，可将氨基酸分为,必需氨基酸,半必需氨基酸,非必需氨基酸,其余氨基酸,Arg His,Lys Val Ile Leu Phe Met Trp Thr,-C-C-CONH2,-C-CONH2,-C-COOH,-C-C-COOH,-H,-CH3,-C-OH,-C-SH,-C-C-S-C,-C-C-C-C-NH3+,Central line,Aliphatic,Amide,Acidic,Imino, Circular,Basic,Sulfur,Hydroxy,Aromatic,Amino Acid Subway Map,稀有氨基酸,属于氨基酸的衍生物，也称为修饰氨基酸 如：胱氨酸、羟赖氨酸、羟脯氨酸、L-甲状腺素等,胱氨酸,羟脯氨酸与羟赖氨酸,非蛋白质氨基酸,不是蛋白质的组成成分 以游离或结合的形式存在于生物界 大都是常见氨基酸的衍生物 还有些是-,-,-, 和D-型氨基酸 一些是代谢中间产物，如瓜氨酸、鸟氨酸； -氨基丁酸等,返回,氨基酸的理化性质,一般物理性质,氨基酸的酸碱性质,氨基酸的光吸收性,氨基酸的化学反应,氨基酸的理化性质,氨基酸为无色晶体，不同氨基酸其晶体形状不相同,氨基酸熔点一般在200300,氨基酸的溶解度,氨基酸的旋光性,氨基酸的紫外吸收,一般物理性质,返回,氨基酸的理化性质,氨基酸的酸碱性质,氨基酸在水溶液中或在晶体状态时主要时以两性离子的形式存在。,氨基酸的理化性质,氨基酸的酸碱性质,氨基酸的等电点 pI,氨基酸的可解离基团的pK值,两个重要概念：,氨基酸的理化性质,氨基酸的酸碱性质,以谷氨酸为例:,pI=1/2（pK1+pK2）1/2 (2.19+4.25)=3.22,氨基酸的理化性质,氨基酸的酸碱性质,氨基酸的每一功能基团可被酸碱所滴定， 可根据氨基酸的滴定曲线来推算pK值。,氨基酸的理化性质,氨基酸的酸碱性质,在等电点以上的任何pH，氨基酸带 净负电荷，在电场中将向正极移动,结论：,在低于等电点的任何pH，氨基酸带 净正电荷，在电场中将向负极移动,在一定pH范围内，氨基酸溶液的pH离 等电点愈远，氨基酸所携带的净电荷 愈大,返回,氨基酸的理化性质,氨基酸的光吸收性,芳香族氨基酸在pH8时紫外吸收光谱,氨基酸的理化性质,氨基酸的光吸收性,芳香族侧链有紫外吸收，所以280nm处吸收 的测定，是定量蛋白质浓度最常用的方法,紫外吸收性受溶液pH的影响,返回,氨基酸的化学反应,1、与亚硝酸反应,含游离-氨基的氨基酸能与亚硝酸起反应，定量地放出氮气，氨基酸被氧化成羟酸,含亚氨酸的脯氨酸则不能 与亚硝酸反应,(一） -氨基参与的反应,氨基酸的化学反应,测定N2 的体积，即可算出氨基酸的含量。 Van Slyke 氨基氮测定法就是根据此反应原理。,2、甲醛滴定法 不仅用于测定氨基酸含量，也常 用来测定蛋白质水解程度,3.Sanger反应( DNFB或 FDNB ),首先被英国的Sanger用来鉴定多肽蛋白质的N末端氨基酸,4.与酰化试剂反应,用于多肽链N末端aa的标记和微量aa的定量测定。 在多肽和蛋白质的人工合成中被用作氨基的保护剂。,氨基酸盐酸盐,5.成盐反应,氨基酸与HCl作用产生氨基酸盐化合物。,RCHCOOH + HCl,NH2,RCHCOOH,NH3+ Cl -,6. 生成西佛碱的反应（Schiff） 西佛碱是某些酶促反应的中间产物（如转氨基反应的中间产物）。,氨基酸盐酸盐,7.脱氨基反应,氨基酸在生物体内经酶催化脱去氨基而转变成酮酸。,RCHCOOH + O,NH2,RCCOOHNH3,O,酶,成盐和成酯：羧基被保护，氨基被活化，重金属盐不溶于水 成酰氯反应：氨基被保护，羧基被活化，在多肽人工合成中常用 脱羧基反应：脱羧酶下脱羧放出CO2 叠氮反应：常用于多肽的合成,(二)-羧基参加的反应（P51）,（三）羧基和氨基共同参加的反应,1.与茚三酮反应 弱酸性溶液中与氨基酸共热生成蓝紫色物质(570 ) 。检测和定量氨基酸和蛋白质的重要反应 脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应不释放NH3，直接生成黄色物质,脯氨酸和羟脯氨酸反应则生成 黄色化合物（440），其结构如下图所示,反应生成的化合物的颜色深浅程度以及CO2生成量，均可作为氨基酸定量分析依据,2.成肽反应,(四)侧链R基参加的反应,蛋白质的化学修饰：就是在较温和的条件下，以可控制的方式使蛋白质与某些试剂起特异反应，以引起蛋白质中个别氨基酸侧链或功能团发生共价化学改变 功能团：羟基、酚基、巯基(包括二硫键)、吲哚基、咪唑基、胍基、甲硫基、非- 氨基和非-羧基等,1.酪氨酸的酚基 米伦反应（Millon)：酚基与HgNO3、与Hg（NO3)2和HNO3作用呈红色。 Folin反应：酚基还原磷钼酸、磷钨酸成蓝色物质。 2.精氨酸的胍基 坂口反应（Sagakuchi）：胍基与-萘酚，次溴酸盐作用生成红色物质。,(四)侧链R基参加的反应,3. CyS侧链上的巯基（SH） 与卤化烷生成稳定的烷基衍生物 巯基能打开氮丙啶的环 巯基能和各种金属离子形成络合物 巯基易受空气或其他氧化剂氧化,二硫键在稳定蛋白质的构象上起作用,(1)与卤化烷生成稳定的烷基衍生物,(2)巯基能打开氮丙啶的环,保护 -SH 以防被氧化 侧链似赖氨酸，为胰蛋白酶水解肽链提供了新位点。,二硫键的打开,氧化剂：过甲酸 还原剂：巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇等,与荧光胺反应,氨基酸可与荧光胺反应，产生荧光产物， 可用荧光分光光度计测定氨基酸含量,返回,根据荧光强度测定氨基酸含量（ng级）。激发波长x=390nm，发射波长m=475nm。,1纸层析法,2薄层层析法,3离子交换柱层析法,4高效液相层析法,5纸电泳,氨基酸的分离与分析,(一)氨基酸的制备,制备氨基酸有4种途径：,从蛋白质水解液中分离提取,应用发酵法生产,应用酶的催化反应生成氨基酸,有机合成法,适宜于中 小规模的生产,可大规模 生产,氨基酸的制备和应用状况,（二）氨基酸的用途,课堂练习题,判断选择题 1. 天然蛋白质中只含19种L-型氨基酸和无L/D-型之分的甘氨酸达20种氨基酸的残基( )。 2.人体中必需氨基酸有8种 ( )。 3.苯丙氨酸是人体必需氨基酸（）。 4.氨基酸在等电点时，应具有的特点是（） A.不具正电荷； B.不具负电荷；C.AB； D.溶解度最大； E.在电场中不泳动。 5将Ala, His, Ser，Glu 和Lys溶于pH4.5的缓冲液中，此五种氨基酸应各带何种电荷？,本节小结,20种氨基酸的结构特征；甘氨酸和脯氨酸结构特点 酸性氨基酸与碱性氨基酸；必需氨基酸与非必需基酸；极性氨基酸与非极性氨基酸 两性离子；pK值与pI；电泳 氨基、羧基和侧链巯基的化学反应 ；茚三酮反应 旋光性；苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的紫外吸收特点,肽：一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合而成的化合物。其中的氨基酸单位称氨基酸残基。 肽键：氨基酸间脱水后形成的共价键称肽键（酰胺键）,二、肽（是氨基酸的线性聚合物）,（一）肽和肽键结构 （二）肽的物理化学性质 （三）天然存在的活性肽,Amino acids are connected head to tail,Formation of Peptide Bonds by Dehydration,Dehydration -H2O,Carbodiimide,名称：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸 写法： Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu或,寡肽：10个氨基酸残基以下。 多肽：多于10个氨基酸残基的肽链。 环状肽：,命名举例,氨基末端,羧基末端,下列五肽命名为丙氨酰谷氨酰亮氨酰缬氨酰组氨酸：,注意：,在开链肽的N端和C端可以有游离的氨基和羧基，而有的开链肽的N端或C端的游离的氨基或羧基被别的基团结合（如烷基化、酰化等）或N端残基自身环化,例如促甲状腺素释放激素的N端残基是谷氨酸，此残基易于自身环化成焦谷氨酰基（氨基与谷氨酸的羧基脱水缩和而成）,举 例,（一）肽和肽键结构,肽键的结构特点： 肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。 组成肽键的原子处于同一平面。 肽键中的C-N键具有部分双键特性，不能自由旋转,呈现相对的刚性和平面化。 肽键的亚氨基没有明显的解离和质子化。 除脯氨酸外，多以反式结构存在。,肽平面、肽单位、二面角,肽平面：连接在肽键上的六个原子共处于一个平面上。 肽单位：肽链主链上的重复结构，C- CO NH C。 二面角：在多肽链里，C碳原子刚好位于互相连接的两个肽平面的交线上。C碳原子上的 C- C 和 C N 可以绕轴旋转，角度为和，这就是-碳原子上的一对二面角。它决定了由-碳原子连接的两个肽单位的相对位置。,(二) 肽的物理化学性质,肽的晶体是离子晶格，熔点高。 具有两性解离和等电点：肽的酸碱性质决定于末端-氨基和-羧基及R基。 pH R基pKa HA A- 具有旋光性。 茚三酮反应、 -氨基和-羧基及R基的反应。 茚三酮反应不是肽的特有反应 N端是脯氨酸或焦谷氨酸时无-氨基试剂的反应 具有双缩脲反应 具紫外吸收：在280nm处有最大吸收峰，可进行肽类定量测定。,寡肽少数几个氨基酸 组成的肽,二肽,三肽,寡肽少数几个氨基酸 组成的肽,肽键 -CO-NH-,3.天然存在的活性肽,具有特殊的生理功能，常称为活性肽（天然肽）。 含有非蛋白质氨基酸和肽键。 例1：- 鹅膏蕈碱（环状八肽，剧毒毒素。能与真核生物的RNA聚合酶II牢固结合而抑制酶的活性）,谷胱甘肽：-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸,还原型谷胱甘肽 GSH,氧化型谷胱甘肽GSSG,临床上主要作为治疗肝病的药物,谷胱甘肽重要的生物功能,维护蛋白质活性中心的巯基 参与二硫化合物相互转化 某些酶的辅酶，在体内氧化还原过程中起重要的作用,肽类应用研究和发展前景,激素,抗生素,活性肽(Natural peptide),生物的生长、发育、细胞分化、大脑活动、肿瘤病变、免疫防御、生殖控制、抗衰老、生物钟规律及分子进化等均涉及到活性肽。生物活性肽是机体内传递信息、调节代谢和协调器官活动的重要化学信使,近年来，多肽的分离纯化、结构分析、化学合成、生物、放射免疫测定、免疫细胞化学以及遗传工程等新技术的应用，新的活性肽不断发现，对活性肽功能认识不断增长，促使这一领域迅速发展,肽的应用及发展,生物活性肽研究中的一大突破,控制脑垂体功 能的下丘脑调 节性肽的发现,单击获取具体信息,大脑神经肽Y(NPY)受体:NPY是一种很强的食欲刺激剂，在过食和肥胖中有着重要作用。但有些研究指出它对酒精中毒也有某种作用，比如，有研究发现，NPY基因的某种变异可能让人更容易酗酒。美国北卡大学霍吉(ClydeW.Hodge)和同事接受记者采访时称，可能酒精能霸占某些人负责食物摄取的那部分大脑系统。 新的研究表明，一种最近发现的脑蛋白质在调控压力和失眠方面扮演着某种角色。科学家们表示，该发现可能有助于开发治疗焦虑和睡眠失调的新方法。这种蛋白质名为神经肽S，是大脑中的一种信号分子。大脑中的很多区域都有神经肽S的受体，其中包括已知与焦虑和警觉性有关的区域。研究人员在8月19日出版的神经元杂志上报告了这一结果。,return,举例,肌肉中存在着鹅肌肽和肌肽都是二肽，前者是-丙氨酰-1-甲基组氨酸，后者是-丙氨酰组氨酸，它们在骨骼肌中含量很高,return,（三）蛋白质的分子结构 一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure),定义 蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。,一、蛋白质的一级结构,主要的化学键 肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,蛋白质构象和蛋白质结构,1.构象（conformation） 指具有相同结构式和相同构型的分子在空间里可能的多种形态；构象形态间的改变不涉及共价键的破裂。每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构或三维结构，称之为蛋白质的构象；一个给定的蛋白质可以有多种构象，但只有一种或少数几种在能量上是有利的。,构型和构象,构型：具有相同的分子式和结构式，但原子在空间的分布 排列不同。氨基酸的构型指碳的构型（D与L型）。 构象：具有相同结构和构型的分子在空间可采取多种形态， 分子所采取的特定形态。（以X射线衍射法为主）,2. 蛋白质结构的不同组织层次,一级结构（即共价结构，指多肽链的氨基酸序列）,二级结构（指多肽链借助氢键形成螺旋和折叠片）,三级结构（指多肽链借助各种非共价键弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状结构）,四级结构（指多聚蛋白质的各亚基之间在空间上的相互缔合关系）,超二级结构和结构域,（一）蛋白质一级结构测定,一.氨基酸组成分析,二氨基酸末端分析,三.蛋白质中肽链的拆离,四.肽链的部分降解 及肽片断的分离,五肽段氨基酸顺序测定及肽段重叠,六.二硫键与酰胺基的定位,（一）蛋白质一级结构的测定,要求 样品必须是均一的。纯度在97%以上 知道蛋白质的相对分子质量,（一）蛋白质一级结构的测定,测定多肽链的数目,拆分多肽链,断开多肽链内的二硫键,测定每一肽链的氨基酸组成,鉴定多肽链的N-末端和C-末端,裂解多肽链为较小的肽段,测定各肽段的氨基酸序列,利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构,确定二硫键的位置,1.测定蛋白质分子中多肽链的数目,经测定末端基（C端或N端），看蛋白质的摩尔数与末端基的摩尔数的比例？,2.拆分蛋白质分子的多肽链和二硫键,1.借助非共价相互作用缔合的（亚基之间） 采用变性剂：8mol/L尿素；6mol/L盐酸胍；SDS处理。 2.通过共价二硫桥（SS）交联的 采用氧化剂或还原剂：将二硫键断裂。 3.分离、纯化多肽链,猪,3.分析每一多肽链的氨基酸组成,待测样品经酸(6mol/L HCl)和碱(5mol/L NaOH)完全水解，用氨基酸分析仪进行测定（或层析法）。 表示方法：每摩尔蛋白质中含氨基酸残基的摩尔数。或100克蛋白质中含氨基酸的克数。,N-末端分析,C-末端分析,4 测定肽链氨基酸序列,N-末端分析,FDNB 法（Sanger 法）,二甲基氨基萘磺酰氯法（DNS 法）,苯异硫氰法（Edman 法）,return,氨肽酶法,二硝基氟苯法（FDNB法）,1945年由Sanger 发明此法,曾用此方法测 定了胰岛素的 N -末端,return,二甲基氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）,1956年 hartley等提出,灵敏度较高 （比FDNB法提高100倍）,样品量小于1毫微摩尔,DNS-氨基酸稳定性较高,此法优点,return,异硫氰酸苯酯法（Edman法）,return,氨肽酶法,氨肽酶是一类肽链外切酶（exopeptidases），它们可以从多肽链的N端逐个地向里切。根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就能知道该蛋白质的N-末端残基顺序,C-末端分析,肼解法,还原法,羧肽酶法,return,肼解法,return,还原法,return,羧肽酶法,主要方法,根据氨基酸释放的动力学曲线， 可确定该肽链的C端氨基酸顺序,return,羧肽酶法,return,肽链间的结合,非共价键,血红蛋白（四聚体） 烯醇化酶（二聚体）,共价键结合,胰岛素 免疫球蛋白等,蛋白质中肽链的拆离,非共价键连接的多肽链,温和条件下可以解离,通过二硫键连接的多肽链,需要较强的条件将二硫键切断,还原法,氧化法,蛋白质中肽链的拆离,还原法,将二硫键还原成巯基,蛋白质中肽链的拆离,还原法,蛋白质中肽链的拆离,还原法,为防止巯基重新氧化，可用 碘乙酸、碘乙酰胺等使其烷化,蛋白质中肽链的拆离,return,氧化法,二硫键用过甲酸氧化为磺酸基而拆开,蛋白质中肽链的拆离,return,化学裂解法,酶水解法,溴化氰法,羟胺法,肽链的部分降解 及肽片断的分离,肽 链 拆 分 成 肽 段,溴化氰法,溴化氰对甲硫 氨酸羧基形成 的肽键特异,肽链的部分降解 及肽片断的分离,return,羟胺法,羟胺能专一地 裂解Asn-Gly 的肽键，酸性 条件下裂解 Asn-Pro肽键,肽链的部分降解 及肽片断的分离,return,酶水解法,常用的酶有:,胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶,胃蛋白酶,嗜热菌蛋白酶等,优越性:,较高专一性,水解产率较高,肽链的部分降解 及肽片断的分离,R1=Lys或Arg侧链（专一性较强，水解速度快）,肽链,水解位点,胰蛋白酶,或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=Phe,Trp, Tyr; Leu,Met和His水解稍慢,肽链,水解位点,糜蛋白酶,R1为Phe, Trp, Tyr或Glu，Asp; Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较慢,肽链,水解位点,胃蛋白酶,R2=Phe, Trp, Tyr; Leu, Ile, Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快,肽链,水解位点,嗜热菌蛋白酶,肽段氨基酸顺序测定 及肽段重叠,例：胰岛素B链的测序 所得资料： N末端残基H C末端残基S 第一套肽段 OUS PS EOVE RLA HOWT 第二套肽段 SEO WTOU VERL APS HO 借助重叠肽确定肽段次序： HOWTOUSEOVERLAPS,二硫键的定位,酰胺基位置的确定,二硫键与酰胺基的定位,将含二硫键的肽段进行酶解，分离出含二硫键的肽，对该肽进行氧化或还原，切断二硫键，生成二个小肽段，将这两个小肽段与原肽链氨基酸顺序进行比较，即可确定二硫键位置,用酸处理含酰胺基的肽链，使其产生游离的NH3和COOH。 测出NH3的数量和可能形成的COOH的数量（不包括C端）， 如两者相等，就可以确定酰胺基的位置,将两套不同肽段的氨基酸顺序进行比较，以获得完整的蛋白质分子的氨基酸顺序,例：有一个A肽： 1）酸水解得到：Ala、Arg、Ser、Glu、Phe、Met； 2）当A肽与FDNB试剂反应后得：DNP-Ala； 3）当A肽用CNBr降解时得到：游离的Ser和一种肽 ； 4）当A肽用胰蛋白酶降解时得到两种肽： 一种含Ala、Arg，另一种含其它氨基酸 5）当A肽用糜蛋白酶降解时得到两种肽： 一种含Met、Ser，另一种含其它氨基酸； 问A肽的氨基酸排列顺序如何？ 答：AlaArgGlupheMetSer,课堂练习,胰蛋白酶专一水解多肽键中（ ） （1）碱性残基N端；（2）酸性残基N端； （3）碱性残基C端；（4）酸性残基C端 丝-酪-丝-甲硫-谷-组-苯丙-赖-色-甘十肽经胰蛋白酶部分水解后，溶液中将有两种肽段存在（ ）,现有五肽,在280nm处有吸收峰,中性溶液中朝阴极方向泳动;用FDNB测得与之反应的氨基酸为Pro; carboxy-peptidase进行处理,第一个游离出来的氨基酸为Leu;用胰凝乳蛋白酶处理得到两个片段,分别为两肽和三肽,其中三肽在280nm处有吸收峰;用CNBr处理也得到两个片段,分别为两肽和三肽;用胰蛋白酶处理后游离了一个氨基酸;组成分析结果表明,五肽中不含Arg. 试定该短肽的氨基酸序列.,课堂练习,4.5 蛋白质的分子构象,指示: 删除样本文档图标,并替换为工作文档图标，如下: 在 Word 中创建文档. 返回 PowerPoint 在“插入”菜单中选择“对象.” 单击“从文件创建” 定位“文件”框中的文件名 确认选中“显示为图标”。 单击“确定” 选择图标 从“幻灯片放映”菜单中选择“动作设置” 单击“对象动作”，并选择“编辑” 单击“确定”,一、蛋白质的二级结构,四、蛋白质的三级结构,五、蛋白质的四级结构,二、维持蛋白质分子构象的化学键,蛋白质是由许多氨基酸单位通过肽键连接起来的，具有特定分子结构的高分子化合物 蛋白质的分子结构可人为划分为一、二、三、四级结构。除一级结构外，蛋白质的二、三、四级结构均属于空间结构，即构象 构象是由于有机分子中单键的旋转所形成的。蛋白质的构象通常由非共价键（次级键）来维系,4.5 蛋白质的分子构象,稳定蛋白质三维结构的作用力,a 盐键（离子键 ） b 氢键 c 疏水相互作用力 d 范德华力 e 二硫键,图46 维持蛋白质空间结构的化学键,共价键,非共价键,氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键 氢键、范德华力虽然键能小，但数量大 疏水相互作用力对维持三级结构特别重要 盐键数量小 二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定,离子键,氢键,范德华力,疏水相互作用力,非共价键(次级键),氢键： 氢键(hydrogen bond)的形成常见于连接在一电负性很强的原子上的氢原子，与另一电负性很强的原子之间 氢键在维系蛋白质的空间结构稳定上起着重要的作用 氢键的键能较低(12kJ/mol)，因而易被破坏,蛋白质分子中氢键的形成,离子键（盐键）： 离子键(salt bond)是由带正电荷基团与带负电荷基团之间相互吸引而形成的化学键。 在近中性环境中，蛋白质分子中的酸性氨基酸残基侧链电离后带负电荷，而碱性氨基酸残基侧链电离后带正电荷，二者之间可形成离子键,非共价键(次级键),蛋白质分子中离子键的形成,非共价键(次级键),范德华氏（van der Waals)引力： 原子之间存在的相互作用力,非共价键(次级键),疏水相互作用： 非极性基团为了避开水相而群集在一起的作用力 二硫键：二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定,X射线衍射研究证明,天然的蛋白质分子并不是一条走向随机的松散肽链，每一种都具有自己特定的空间结构。线性的多肽链在空间中折叠成特定的三维结构，这种空间结构通常称为蛋白质的高级结构或分子构象 肽键不能自由转动，具有部分双键性质,酰胺平面，也叫肽平面，多为反式,（一）多肽主链的基本结构,肽链构象,肽键平面 由于肽键具有部分双键的性质，使参与肽键构成的六个原子被束缚在同一平面上，这一平面称为肽键平面或肽单元,（一）多肽主链的基本结构,指示: 删除样本文档图标,并替换为工作文档图标，如下: 在 Word 中创建文档. 返回 PowerPoint 在“插入”菜单中选择“对象.” 单击“从文件创建” 定位“文件”框中的文件名 确认选中“显示为图标”。 单击“确定” 选择图标 从“幻灯片放映”菜单中选择“动作设置” 单击“对象动作”，并选择“编辑” 单击“确定”,决定,肽链构象,肽链中的二面角和,二面角,角绕C-N键旋转的角度,角绕C-C键旋转的角度,二面角可以在00+1800 范围内变动。通过二面角 的旋转，多肽链可以形成 各种各样的折迭方式。,二面角决定肽链的构象,肽链中和这一对 二面角决定了相邻的 两个酰胺平面所有原 子在空间上的相对位 置，就决定了肽链的 构象,注意,注意,二面角（、）所决定的构象能否 存在，主要取决于两个相邻肽单位中非键合 原子之间的接近有无障碍。,蛋白质的二级结构,二级结构:是指多肽链借助氢键排列成沿一个方向具有周期性结构的构象 常见的二级结构： -螺旋、-折叠、-转角和无规则卷曲,（二）二级结构的基本构象,指示: 删除样本文档图标,并替换为工作文档图标，如下: 在 Word 中创建文档. 返回 PowerPoint 在“插入”菜单中选择“对象.” 单击“从文件创建” 定位“文件”框中的文件名 确认选中“显示为图标”。 单击“确定” 选择图标 从“幻灯片放映”菜单中选择“动作设置” 单击“对象动作”，并选择“编辑” 单击“确定”,1螺旋结构 (Helix),2折叠 (Pleated structure),3转角 (Turn),4无规卷曲 (Random coil),5突起 ( Protuberance),最常见、含量最丰富 结构特点： 多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离0.15nm. 肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的-NH与第四个氨基酸残基的-CO形成氢键。 -螺旋为右手螺旋 R基在螺旋外测,= -57O, = -47O,3.6个氨基酸残基 螺距为0.54nm,1.-螺旋（3.613螺旋）,左手和右手螺旋,-螺旋,影响-螺旋形成的因素： 溶液的pH、溶剂体系、温度。 氨基酸组成和排列顺序、R基的电荷性质、R基的大小有关。 Pro残基和Gly残基处不能形成。,2 -折叠,-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联成。肽链的主链呈锯齿状折叠构象 在-折叠中，-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm,-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直 -折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反,-折叠,结构特点： 氢键与肽链长轴接近垂直。 多肽主链呈锯齿状折叠 侧链R基交替地分布在片层平面的两侧 分平行和反平行两种类型,-折叠包括平行式和反平行式两种类型,3. -转角,在-转角部分，由四个氨基酸残基组成；这类结构主要存在于球状蛋白分子中 甘氨酸和脯氨酸常出现在转角中,转角,转角,转角,转角结构通常负责各种二级结构单元之间的连接作用，它对于确定肽链的走向起着决定性的作用,-转角,-转角是多肽链180回折部分所形成的一种二级结构，其结构特征为： 主链骨架本身以大约180回折 回折部分通常由四个氨基酸残基构成 构象依靠第一残基的-CO基与第四残基的-NH基之间形成氢键来维系,-转角,转角结构,转角,转角结构,转角,4 无规卷曲(Random coil),肽段有更大的任意性。 受氨基酸残基侧链的影响较大，经常是构成酶活性部位和其它蛋白质特异的功能部位。,多肽链主链不规则随机盘曲形成的构象,5 突起,突起是在折叠的2个相邻的氢键中多出一 个氨基酸残基，形成一个突起，干扰其氢键配对 这类肽段的外形和希腊字母“”相似，故称为环形。从形式上看，环形可以看成是转角的延伸。,全-结构,质体蓝素,烟草坏死病毒外壳蛋白,全-结构,磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶的三级结构,-结构,RNase的分子结构,-螺旋,-折叠,-转角,无规卷曲,各类氨基酸与蛋白质二级结构关系,蛋白质的三级结构,蛋白质的三级结构是指蛋白质分子或亚基内所有原子的空间排布，也就是一条多肽链的完整的三维结构 维系三级结构的化学键主要是非共价键（次级键），如疏水键、氢键、盐键、范德华力等，但也有共价键，如二硫键等 三级结构是由氨基酸的长程顺序决定 转弯的氨基酸残基（脯、苏、甘和丝氨酸）,结构域(domain)： 在一级结构上相距较远的氨基酸残基，通过三级结构的形成，多肽链的弯折，彼此聚集在一起，从而形成一些在功能上相对独立的，结构较为紧凑的区域，称为结构域（domain）。 在蛋白质结构中形成一紧密的结构,具有特殊的功能,多为蛋白质的活性部位。有的蛋白质分子有一个结构域,有的有多个，如纤连蛋白含有6 个结构域,胰岛素分子的三级结构,溶菌酶分子的三级结构,磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶的三级结构,肌红蛋白的三级结构,蛋白质的四级结构,蛋白质的四级结构(Quaternary structure):是指由两条或两条以上的具有三级结构的多肽链通过非共价键聚合而成的特定构象 这种蛋白质分子中，最小的单位通常称为亚基或亚单位Subunit，它一般由一条肽链构成，也可由二条或多条多肽链组成，相互间以二硫键相连。 亚基缔合的驱动力主要是疏水相互作用。,血红蛋白(hemoglobin)的四级结构,（一）蛋白质一级结构与功能的关系,1.同功蛋白质氨基酸种属差异和分子进化,蛋白质一级结构的种属差异十分明显，但相同部分氨基酸对蛋白质的功能起决定作用。根据蛋白质结构上的差异，可以断定它们在亲缘关系上的远近,蛋白质分子具有多样的生物学功能，需要一定的化学结构，还需要一定的空间构象,4.6 蛋白质结构与功能的关系 P64,细胞色素C的一级结构与物种进化间的关系-物种进化树（phylogenetic tree）,基因突变引起的某个功能蛋白的某一个或几个氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变，功能部分或全部丧失，由此引起的疾病称分子病,2.同功蛋白质氨基酸个体差异和分子病,镰刀型红细胞贫血的分子基础,HbA: Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys HbS: Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys 链 1 2 3 4 5 6 7 8,结果：Glu变为疏水性的Val，使HbS分子表面的负电荷减少，亲水基团变为疏水基团，使HbS分子聚合，溶解度降低，红细胞变形，呈镰刀状，并易于破裂溶血 治疗：体外，KCNO共价修饰链N端Val残基，使亲水性增加，可防止HbS分子间的缔和,（二）空间结构与功能的关系构象决定功能 变构效应,当血红蛋白的一个亚基与氧分子结合以后，可引起其他亚基的构象发生改变，对氧的亲和力增加，从而导致整个分子的氧结合力迅速增高，使血红蛋白的氧饱和曲线呈“S”形。这种由于蛋白质分子构象改变而导致蛋白质分子功能发生改变的现象称为变构效应 一个蛋白质与它的配体或其它蛋白质结合后，蛋白质的构象发生变化，使它更适合于功能需要。小分子O2称为变构剂,(一)胶体性质,蛋白质的分子直径2-20nm之间，在胶体颗粒（1-100nm）的范围。蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为在蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如NH3、COO-、OH-、SH、CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易在蛋白质颗粒外面形成一层水膜。,4.7 蛋白质的性质及纯化,胶体性质 1、透析 2、超滤,(二)两性解离及等电点,蛋白质的等点电（pI）:是蛋白质所带电荷正负相等，净电荷为零时的溶液pH值。此时的蛋白质为兼性离子。,COOH Pr NH3+,COO Pr NH3 +,COO Pr NH2,+ H,H+,H,H,pHpI,等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动,通电,电泳,电泳,1 、概念：蛋白质受到某些理化因素的影响，其空间结构发生改变，蛋白质的理化性质和生物学功能随之改变或丧失，但未导致蛋白质一级结构的改变，这种现象叫变性作用（denaturation） 2.蛋白质变性的因素 物理因素：加热、紫外线、超声波、高压等 化学因素：强酸、强碱、脲、盐酸胍、去垢剂、重金属盐等,（三）蛋白质变性,3.蛋白质变性后的表现 生物活性丧失（酶）； 溶解