《氨基酸自动分析仪》PPT课件.ppt

第三十八章 氨基酸自动分析仪,概述,实质：高效液相色谱仪 填料：强酸型阳离子交换树脂 检测器：可见或荧光分光光度计 选择性好、准确度高 分析速度快，灵敏度高,概述,20世纪40年代，开始探求色谱法分析氨基酸； 提高洗脱流速、改良柱直径、填料粒度，提高分析速度； 20世纪80年代，键合反相分配色谱、柱前衍生技术的发展； 目前，配合微机控制程序和处理数据，成为氨基酸最准确可靠的分离测试方法。,概述,本章主要内容 1、传统离子交换色谱专用氨基酸分析仪 2、柱前衍生反相高效液相色谱的氨基酸分析,第一节 基本原理,先将氨基酸混合物在离子交换树脂柱上进行分离，然后按照分离后的氨基酸衍生。根据衍生产物的特性，选择适当的检测器检测并进行定性与定量分析。,1.1 离子交换树脂,1.填料：磺酸型强酸阳离子交换树脂 2.苯乙烯为主体； 3.离子交换的活性基团：磺酸根（连接在苯乙烯中乙烯基的对位上）； 4.与二乙烯基苯交联，形成不溶的高分子骨架，易吸水溶解。 5.交联剂所占比例决定网状结构的孔径大小（氨基酸：8%12%的交联度）。,6.Na+型（蛋白质水解液中的氨基酸分析），Li+型（全部氨基酸的分析） 7、考虑磺化程度、交联剂纯度和类型、粒度大小（510um）。,1.2 氨基酸在色谱柱中的分离,XSO3-H3N+CHRCOOH + Na+,PH减小,PH增大,PH小于氨基酸的等电点时，氨基酸带正电荷，可被磺酸基团吸引，随着PH升高或离子强度增大，氨基酸所带正电荷减少，吸引力下降乃至消失而被洗脱下来。,1、不同的氨基酸，其等电点、极性及相对分子质量大小不同，其洗脱顺序不同； 2、一般先后顺序： 酸性和带羟基的氨基酸（最早） 中性氨基酸（其次） 碱性氨基酸（最后） 3、同类氨基酸中，短链氨基酸先被洗脱； 4、碳数相同的氨基酸，有支链的比无支链的先洗脱出来。,1.2 氨基酸在色谱柱中的分离,氨基酸的分离影响因素： 离子交换树脂的型号、粒度、交联度； 柱长、直径、柱温； 洗脱液的阳离子类型、PH值、离子强度、洗脱梯度、流速及其中有机溶剂含量。,1.2 氨基酸在色谱柱中的分离,1、3 衍生及检测,多数氨基酸无生色基团，在紫外可见光区无吸收（Phe、Trp、Lyr例外），需要将它们衍生，成为具有紫外、可见光吸收或能产生荧光的物质才可以检测。,衍生方式：,1、柱前衍生法： 将AA混合物先衍生后，在用反相 分配色谱法分离，测定其紫外吸收或产生的荧光强度。,2、柱后衍生法： 将AA混合物用离子交换色谱法分离，在把分离后的氨基酸衍生为具有可见吸收或产生荧光的物质，然后测定。,常用的衍生方法：,1、3 衍生及检测,（1）茚三酮法,多数氨基酸与水合茚三酮在弱酸条件下共热，引起AA的氧化脱氨、脱羧反应，水合茚三酮与氨合还原茚三酮反应，生成紫色DYDA，最大吸收570nm（脯氨酸与羟脯氨酸例外，生成黄色化合物，最大吸收440nm）。 最后根据吸光度与峰面积的关系定性定量分析。,（2）邻苯二甲醛（OPA）法,1、3 衍生及检测,AA分离后，可与邻苯二甲醛混合，在常温、乙硫醇或-巯基乙醇存在下生成一种强荧光物质。 该衍生物在激发波长340nm、吸收波长455nm，可用荧光光度计检测其发射的荧光。 此外，脯氨酸与羟脯氨酸需要在氧化剂（NaClO）作用下，开环变为一级胺，然后与OPA反应。,第二节 氨基酸分析仪的结构性能,2、1 结构与流程 见图38-7 （p181）,2、2 主要部件功能,第二节 氨基酸分析仪的结构性能,（1）输液系统,组成：泵、切换阀或梯度洗脱装置；,作用：输送缓冲液、衍生试剂、 再生液；,要求：流量恒定、流速稳定、较高的输出压、输出流量范围大。,第二节 氨基酸分析仪的结构性能,（2）进样分离系统,组成：进样器、色谱柱,AA最佳分离温度：3070度，需恒温，一般柱温升高，出峰时间缩短。,（3）检测系统,第二节 氨基酸分析仪的结构性能,取决于AA衍生的方式:,茚三酮法，柱后衍生。茚三酮与分离后的AA混合并在100左右的水浴中反应15min，最后由紫外检测仪检测。 OPA法，分离柱流出液与NaClO混合，再与OPA混合，生成荧光衍生物，采用荧光光度计分析测定。,（3）程序控制系统 （4）数据处理系统及其他辅助系统,第二节 氨基酸分析仪的结构性能,常见的仪器的主要性能：见表38-4（p183）,第三节 试样的前处理方法,3、1 上机分析试样液的要求,试液澄清透明无可见杂质，放置或离心不产生沉淀； 试液无色或略带浅黄色，否则需脱色处理（活性炭对芳香族AA有吸附，导致检测结果偏低）； 含盐量要低； 无蛋白质或肽类物质（水解充分）； 以PH2。2为宜； AA浓度以0。144mg/mL（110ng/50ul）为宜。,3、2 试样前处理的方法,第三节 试样的前处理方法,（1）酸水解,盐酸水解法 被破坏的：Met、Trp； 不易水解：Il