12C6+离子辐射对细胞存活增殖及模拟失重和辐射对家蚕卵发育的影响.doc

12C6+离子辐射对细胞存活增殖及模拟失重和辐射对家蚕卵发育的影响作者：续惠云罗明志孟芮张维高翔李文建商澎【摘要】目的：观察重离子辐射后人骨肉瘤细胞MG63、人胚胎皮肤成纤维细胞ESF1和人胚胎肝正常细胞HEL1的生存和增殖情况，及重离子辐射和模拟失重环境处理后家蚕卵的孵化和发育情况，初步探讨重离子辐射对细胞及复合环境对家蚕卵的一些生物学效应.方法：利用超导磁体模拟失重环境，利用重离子加速器产生12C6+离子，用不同剂量辐射细胞和家蚕卵，检测在重离子辐射后细胞的存活和克隆形成能力及复合条件下家蚕卵的发育情况.结果：HEL1细胞在0.1Gy时存活率已经开始降低，且随辐射剂量的增大这种影响也增加，到1.5Gy时存活率降低50%.ESF1细胞在1.5Gy时存活率下降约20%，但辐射对骨肉瘤MG63细胞的存活率影响不大.HEL1和ESF1细胞受到0.1Gy的辐射后克隆形成能力就明显降低90.2%和79.1%，而MG63细胞一直保持较高的克隆形成率，直到1.5Gy时迅速降低75%.家蚕的出蚁率随辐射剂量的增大而降低，到30Gy时出蚁率降到2.22%.当辐射剂量为010Gy时，家蚕卵在两种不同重力条件下的孵化率没有明显差异.但当辐射剂量增加到15,20和30Gy时，失重环境明显促进了家蚕卵的孵化.另外，失重环境下家蚕卵的孵化时间比正常条件下缩短约3d左右.同时，高剂量的辐射处理会延迟家蚕幼虫的生长.结论：重离子辐射降低了细胞的存活和增殖能力，同时影响了家蚕从受精卵到幼虫的发育，降低了出蚁率.失重环境可以缩短家蚕卵的孵化时间.【关键词】重离子辐射；失重；辐射效应；细胞增殖；家蚕卵；发育0引言辐射和微重力在深空环境同时存在，且都是对航天员生命安全威胁很大的环境因素1，研究两者的复合生物学效应，可以为深空探测中航天员的健康保障提供理论支持.对此，国外已经进行了地基水平和真实空间的一些研究，如2002年开始在国际空间站启动的ALTEA/ALTEINO计划，研究了复合效应对航天员中枢神经系统的影响，并做了地基的对照实验1-2.我国科学家对复合效应的研究还刚刚起步，进行了一些地基实验，主要集中在对这两种危害的防护方面3-4.本研究利用中国科学院兰州近代物理研究所的重离子加速器（HIRFL）作为地面模拟深空辐射的平台，利用大梯度强磁场超导磁体作为模拟失重环境的地基平台，初步探讨重离子辐射对细胞及复合环境对家蚕卵的一些生物学效应.1材料和方法1.1材料大梯度强磁场超导磁体由西北工业大学自行设计、日本制造.人胚胎皮肤成纤维细胞ESF1和人胚胎肝正常细胞HEL1购自中国医学科学院细胞库，人骨肉瘤细胞MG63购自中国科学院上海细胞库.家蚕品种为大造P50，蚕卵购自江苏省镇江蚕业研究所.饲养用家蚕人工养殖饲料购自山东蚕业研究所.1.2方法1.2.1细胞培养ESF1细胞和HEL1细胞培养在含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液中，MG63细胞培养在含100mL/L胎牛血清的MEM培养液中.辐射前1d将细胞接种在直径35mm的培养皿中，置于37,50mL/LCO2的培养箱中培养24h后进行辐射.1.2.2家蚕饲养蚕卵在温度25，相对湿度70%下孵化，孵化后，均在常规条件下饲养.1.2.3重离子辐射重离子种类为12C6+，LET为49.3keV/m，剂量率为200mGy/m，能量为45MeV/A.根据以前的一些实验结果，细胞的辐射剂量定为0，0.1，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，3Gy.家蚕卵随机分为两组，一组用0，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，5，10，15，20，30Gy的剂量进行幅照后常规孵化，另一组在这些剂量辐射后放入超导磁体进行孵化.1.2.4细胞存活实验辐射后细胞放置4h，用40g/L台盼蓝染色，分别对死活细胞进行计数，检测重离子辐射对三种细胞存活率的急性影响.1.2.5细胞克隆形成实验辐射后将细胞稀释成单细胞悬液，按不同的预置数接种在60培养皿中，培养10d，固定染色后统计多于50个细胞的集落数.细胞克隆生成率=(集落数/接种细胞数)100%.1.2.6家蚕卵孵化发育实验辐射后在25培养箱中孵化家蚕，计算其孵化率.并将孵化出的蚕进行饲养，观察其生长过程和结茧时间，计算孵化率.从孵化第12日开始称量家蚕幼虫体质量.每2d称量1次，每组随机称量30头，绘制生长曲线.待蚕结茧后，称量茧质量（每组随机称量30个蚕茧）.统计学处理：所有实验数据都利用Prism3.0软件采用t检验方法进行统计分析.2结果2.1重离子辐射对细胞存活率的影响HEL1细胞受到辐射的影响最大，在0.1Gy时存活率已经开始降低，且随辐射剂量的增大这种影响也增大，到1.5Gy时存活率降低50%，差异有统计学意义（P0.01）.ESF1细胞在1.5Gy时存活率下降约20%，但差异无统计学意义，而MG63细胞的存活率在辐射后4h时受到的影响很小（图1），差异无统计学意义.图1重离子辐射对细胞存活率的影响2.2重离子辐射对细胞克隆形成能力的影响与0Gy时相比，HEL1细胞和ESF1细胞在0.1Gy的辐射剂量时克隆形成的能力降低90.2%和79.1%，并随辐射剂量变化有一些波动，但其下降都在50%以上.而MG63细胞一直保持比正常细胞更高的克隆形成能力，直到0.5Gy才开始降低，并在1.5Gy时迅速降低到未辐射细胞的25%（图2）.图2重离子辐射对细胞克隆形成能力的影响2.3重离子辐射对家蚕卵孵化和发育的影响辐射后家蚕的出蚁率都随着照射剂量的增大而降低，至30Gy辐射剂量时，出蚁率降到2.22%（图3）.当辐射剂量为010Gy时，家蚕卵在两种不同重力条件下的孵化率差异无统计学意义.但当辐射剂量增加到15,20，30Gy时，失重环境与正常条件相比，明显促进了家蚕卵的孵化（P<；0.05）.另外，比较两种不同重力条件对家蚕孵化的影响发现，相同辐射剂量的时候，在磁体中发育的家蚕比磁体外发育的出蚁时间提前了3d.bP<；0.01vs模拟失重组.图3重离子辐射对家蚕卵孵化率的影响家蚕发育实验的结果显示，在失重和常重力两种条件下，重离子辐射对家蚕生长有影响，但差异无统计学意义（图4）.两种重力水平下均表现出随辐射剂量的增加，家蚕生长的减慢.低剂量的重离子辐射对家蚕幼虫的生长影响不明显，但随辐射剂量增加到10Gy，辐射组家蚕与对照组相比生长减慢，且随着照射剂量的增加，影响程度加大（图5，失重条件下数据未显示）.蚕茧称量的结果显示，不同的辐射和重力水平对茧重的影响不明显.但重离子辐射能造成家蚕结茧时间的延迟，当剂量增加到20Gy时，家蚕结茧时间平均延迟约34d.图4不同重力条件对家蚕幼虫生长的影响3讨论载人深空探测是各航天大国今后进一步进行空间资源开发的方向.在深空环境，辐射是在失重下的辐射，失重又伴随着辐射，研究两者的复合生物学效应，对航天员健康保障具有重要的指导意义.图5常重力条件下重离子辐射对家蚕生长的影响本实验采用加速器产生的重离子模拟深空辐射，结果发现三种细胞对辐射的反应不同，HEL1细胞和ESF1细胞的存活率和克隆形成能力都随辐射剂量的增大而降低，而骨肉瘤细胞MG63在辐射后4h的存活率变化不大，表现出了比正常细胞更强的抗辐射能力，但在辐射剂量增大到1.5Gy后，其克隆形成能力迅速降低.因此，重离子辐射能影响细胞的生存和增殖能力，但这种影响与辐射剂量和细胞种类都有关系.家蚕因为个体小、生长周期短、易于饲养，因此成为空间实验好的动物模型.本实验采用重离子辐射和失重环境处理家蚕卵，结果发现重离子辐射抑制了家蚕卵的孵化过程，并表现出较好的剂量效应关系.同时观察发现，部分没有孵化的蚕卵已经转青，提示辐射并不能完全抑制蚕卵发育的起始，而是将发育的进程终止在特定时期.家蚕卵在失重条件下孵化时间提前了3d，提示失重和辐射的复合条件会影响家蚕的早期胚胎发育过程.该结果与Shi等5的空间研究结果有较好的相似性，他们发现空间飞行搭载能使家蚕滞育卵的孵化时间缩短3d.另外，我们的结果还显示高剂量的重离子辐射处理家蚕卵会影响家蚕幼虫后续的生长，主要表现为延迟生长效应，该结果与一些已有的空间研究结果相一致.Kotani等6发现失重主要影响早期胚胎发育，而宇宙射线则主要影响了生长，且失重和宇宙辐射有协同作用.Reitz等7在“MissionD1”和“COSMOS1987”研究了昆虫胚胎的发育情况，结果显示失重降低了孵化率，辐射造成了结构异常，而复合效应造成了极高频率的结构异常.本实验中也观察到失重和重离子辐射对家蚕卵早期胚胎发育的影响不是简单的相加或相减，而是相互作用的一种复合效应.综上所述,重离子辐射降低了细胞的存活和增殖能力，同时影响了家蚕从受精卵到幼虫的发育，降低了出蚁率.失重环境可以缩短家蚕卵的孵化时间.致谢感谢兰州大学高清祥老师、中科院近物所党秉荣老师和韩晶同学在实验中给予的帮助！【参考文献】1FinoLD,BelliF,BidoliV,etal.ALTEAdatahandlingJ.AdvSpaceRes,2006,37:1710-1715.2NariciL,BidoliV,CasolinoM,etal.ALTEA:Anomalouslongtermeffectsinastronauts.AprobeontheinfluenceofcosmicradiationandmicrogravityonthecentralnervoussystemduringlongflightsJ.AdvSpaceRes,2003,31(1):141-146.3ZhangL,XieM,LiYZ,etal.AdjustiveeffectsofTaikongXielidecoctiononimmunologicalfunctioninsuspendedandsuspensionaddingirradiationratsJ.ChinJClinRehabil,2005,9(43):98-100.4ZhangXY,WangGZ,DingB,etal.EffectsofsimulatedweightlessnessandirradiationonmetabolismofratmyocardialcellsculturedinvitroJ.SpaceMedMedEng(Beijing),1998,11(4):258-261.5ShiZZ,ZhuangDH,GuiZZ,etal.FlightexperimentofsilkswomonboardRussianbiosatelliteJ.SpaceMedMedEng(Beijing),1995,8(3):220-224.6KotaniE,FurusawaT,NagaokaS,etal.Somaticmutationinlarvaeofthe