SBHL对HeLa细胞生长抑制作用的影响.doc

SBHL对HeLa细胞生长抑制作用的影响【关键词】端粒酶【Abstract】AIM:ToobservetheinhibitingeffectsofSBHLonthegrowthofHeLacellsandtoinvestigatetheinhibitingmechanisms.METHODS:TheproliferationofHeLacellswasobservedbyMTTassayandthechangesofthecellcycleofHeLacellstreatedwithSBHLwereanalyzedbyflowcytometry.TheexpressionsofhTRTgeneweredetectedbyimmunohistochemistrytechniquesandthedifferentiationofHeLacellswasobservedbyWrightGiemsastaining.RESULTS:TheproliferationofHeLacellswasinhibitedat0.1-20.0mg/LSBHL.TheinhibitingeffectincreasedgraduallyfollowingtheincreaseofconcentrationofSBHL.ThepercentageofHeLacellsinSphasedecreasedandthepercentageofcellsinG1phaseincreasedafterthecellsweretreatedbySBHL,indicatingthatSBHLarrestedHeLacellsinG1phaseandthusthesynthesisofDNAwasinhibited.AftertreatmentbySBHL,theexpressionsofhTRTgeneofHeLacellsdecreasedobviously.DifferentiatedHeLacellswwerefoundaftertreatmentbySBHL.CONCLUSION:ThegrowthofHeLacellsisinhibitedobviouslybySBHLandtheinhibitingeffectisdependentontheconcentrationofSBHL.TheexpressionsofhTRTgenearedownregulated,thetelomeraseactivityisinhibitedandthegrowthofHeLacellisinhibited.【Keywords】SBHL；HeLacell；telomerase；flowcytometry；cellcycle；celldifferentiation【摘要】目的：观察SBHL对HeLa细胞生长的抑制作用，并探讨其作用机制.方法：用MTT比色法观察不同浓度SBHL对HeLa细胞增殖的影响；用流式细胞术对细胞周期进行分析；用免疫组化方法观察SBHL对HeLa细胞人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)基因表达的影响.用瑞氏姬姆萨染色法观察SBHL对HeLa细胞形态的影响.结果：0.120.0mg/LSBHL对HeLa细胞增殖有明显的抑制作用，这种抑制作用随SBHL浓度的增加而增加；流式细胞术对细胞周期进行分析的结果显示，随着SBHL浓度的增加，S期细胞含量逐渐降低，G1期细胞含量逐渐增加，SBHL将细胞阻滞于G1期，抑制DNA合成.SBHL处理的HeLa细胞与对照组相比，hTRT基因的表达明显降低；瑞氏姬姆萨染色结果表明SBHL可使HeLa细胞向良性分化.结论：SBHL明显抑制HeLa细胞生长呈浓度依赖性.SBHL下调HeLa细胞hTRT基因的表达，抑制端粒酶活性.【关键词】SBHL；HeLa细胞；端粒酶；流式细胞术；细胞周期；细胞分化0引言龙葵为茄科茄属植物，全草入药.龙葵具有清热解毒、化痰止咳等作用.药理实验表明有抗菌、消炎、抗肿瘤等作用1.SBHL是从龙葵浓缩果汁中提取出的一种游离的生物碱盐酸盐，在此盐分子上增加活性基团，保持其原有生物学活性基础上，使其产生新的高效活性.Putalun等2对龙葵的成分、分离方法、抗凝血及抗肿瘤作用进行了研究.龙葵总生物碱或其中成分有抑制肿瘤作用，而由龙葵总生物碱转化而成的有效成分SBHL，其抗肿瘤活性及抗肿瘤作用机制无报道.我们观察了不同浓度SBHL对HeLa细胞生长的抑制作用，并探讨了SBHL对HeLa细胞生长抑制作用的机制.1材料和方法1.1材料HeLa细胞由长春肿瘤研究所提供；SBHL由北华大学医学院刘良教授提供，用二蒸水配置成贮液.用RPMI1640培养液配制成终浓度为0.01,0.1,1.0,10.0和20.0mg/L.RPMI1640,胰蛋白酶和胎牛血清为Gibco公司产品；MTT,PI和DMSO均为Sigma公司产品.DAB显色试剂盒和通用型SP试剂盒和人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)检测试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司.1.2方法用胰酶消化处于对数生长期细胞，接种于96孔培养板中，以不同浓度梯度SBHL作用于HeLa细胞，每个浓度3个孔，同时设不加SBHL对照孔，培养液空白孔，对照孔各3孔.培养5d，每日取1板，加入MTT(1g/L)，继续培养4h后，移去上清并用吸水纸吸干培养液，再加入DMSO，振荡至结晶完全溶解后，用酶标仪测定A490nm.将处于对数生长期的HeLa细胞加入25mL培养瓶中，当80%90%细胞汇合时，加SBHL作用72h，用胰酶消化收集细胞，PBS洗2次，4固定24h后，加入RNase，37水浴消化1h，再加入PI，避光4染色30min200目网筛滤过，上流式细胞仪检测HeLa细胞周期变化.将1.0mg/LSBHL加入对数生长期细胞培养72h,消化成单个细胞，将其涂在玻片上，加丙酮固定.按试剂盒说明进行操作.用SP免疫组化法分别检测HeLa细胞hTRT基因的表达，图片置于摄像显微镜下，选取观察部位.随机选取35个视野，在图像分析仪下测定灰度值，灰度值用Y=0.299R+0.587G+0.114B计算.收集对数生长期细胞，用胰酶消化，制成细胞悬液，加SBHL终浓度为1mg/L，培养72h后取出盖片，乙醇固定.加瑞氏姬姆萨染色，在显微镜下观察细胞形态.统计学处理：采用SPSS10.0软件处理，两样本均数的t检验.2结果2.1MTT比色法0.01mg/LSBHL对HeLa细胞生长抑制作用与对照组相似(P>；0.05)，0.120.0mg/LSBHL处理的HeLa细胞组与对照组相比均有显著性差异（P<；0.05）,说明0.120.0mg/LSBHL对HeLa细胞的增殖具有明显抑制作用，而且随着SBHL浓度的增加，抑制作用增强(Tab1,Fig1).表1SBHL对HeLa细胞的生长抑制作用（略）2.2流式细胞术经SBHL作用后HeLa细胞G1期增加，S期减少，说明SBHL可以将细胞阻滞于G1期，抑制DNA合成(Tab2).表2SBHL对HeLa细胞周期的影响（略）2.3hTRT基因表达未经SBHL处理的HeLa细胞核染成棕黄色阳性(Fig2A).10.020.0mg/LSBHL处理的HeLa细胞72h后，细胞核被染成棕黄色的HeLa细胞明显减少，大部分细胞核染成蓝色，呈阴性(Fig2B)，表明hTRT基因表达受到明显抑制.2.4HeLa细胞形态经瑞氏姬姆萨染色，光镜观察可见未经SBHL处理的HeLa细胞排列密集，细胞呈圆形，大小不一，瘤巨细胞多见；细胞核质比例大，核大、核仁多；而SBHL处理组细胞随药物浓度增大细胞排列稀疏，呈长梭形或多边形，胞质伸出长的不规则突起，相互联接成网状结构，细胞大小趋向一致，瘤巨细胞少见；细胞核、质比例增大，核小，且核仁减少，染色变浅(Fig3A,B).3讨论SBHL是从龙葵中提取出的龙葵总生物碱，经生物转化后的主要活性成分，其抑制肿瘤作用研究尚未见报道.我们观察到0.120.0mg/LSBHL对HeLa细胞具有明显的抑制作用.对HeLa细胞周期有明显的影响，G1期细胞增加，S期细胞减少，说明SBHL可以将细胞阻滞于G1期，抑制DNA合成.SBHL可诱导HeLa细胞形态趋向良性分化，部分恢复正常细胞形态，细胞排列稀疏，呈长梭形或多边形，胞质伸出长的不规则突起，相互联接成网状结构，细胞大小趋向一致，瘤巨细胞少见；核小，且核仁减少，染色变浅.细胞功能的体现也是肿瘤细胞分化的标志.从功能方面来看，细胞增殖、细胞分裂和集落形成均显示HeLa细胞生长明显受抑制.同时，流式细胞术分析DNA周期也发现细胞被阻止于G1期，S期细胞百分率下降.端粒酶是一种依赖RNA的逆转录酶，能够延长染色体末端的端粒长度.正是端粒酶的活化通过对端粒长度的维持使细胞得以永生化，而永生化也正是细胞恶变的必经步骤3.端粒酶在正常人体细胞中并不表达，在多种肿瘤中均可检出端粒酶活性4,5.端粒酶催化亚单位即hTRT是细胞永生化及恶性肿瘤发生过程中的端粒酶活化的主要限速步骤，hTRT基因表达可以反映端粒酶活性，与端粒酶活性具有平行关系.我们发现未用SBHL处理的HeLa细胞hTRT基因高度表达，用SBHL处理后的HeLa细胞hTRT基因表达明显降低.因此，SBHL可能通过下调hTRT基因表达，抑制端粒酶活性，使细胞分裂中端粒逐渐缩短，最终使细胞死亡.总之，SBHL主要通过下调hTRT基因的表达，抑制HeLa细胞的生长.【参考文献】1谢启梅，谢军荣.龙葵在肿瘤治疗中的应用J.江西中医药，1996；27(2):52-53.XieQM,XieJR.TheuseofsolamarginetreatedontumorsJ.JiangxiChinDrug,1996；27(2):52-53.2PutalunW,TanakaH.SurveyofsolasodinetyReglycoalkaloidsbywesternblottingandELISAusingantisolamarginemonoclonalantibodyJ.BiolPharmBull,2000；23（1）：72-75.3HuschtschaLI，BartierWA，AnderssonCE,etal.CharacteristicsofcancercelldeathafterexposuretocytotoxicdrugsinvitroJ.BrJCancer,1996；73:54-60.4MandalM,MaggrrarSB,SharmaN,etal.Bcl2preventCD95(Fas/APOI)induceddegradatro