mTOR信号途径在儿童再生障碍性贫血T细胞中异常活化的初步研究mTOR信号途径在儿童再生障碍性贫血T细胞中异常活化的初步研究

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硕士学位论文论文题目MTOR信号途径在儿童再生障碍性贫血T细胞中异常活化的初步研究研究生姓名孙豫兰指导教师姓名何海龙专业名称儿科学研究方向小儿血液与肿瘤论文提交日期2013年3月MTOR信号途径在儿童再生障碍性贫血T细胞中异常活化的初步研究中文摘要IMTOR信号途径在儿童再生障碍性贫血T细胞中异常活化的初步研究中文摘要目的1通过检测再生障碍性贫血(AA)患儿T细胞内MTOR信号途径分子的表达水平,研究该信号途径在儿童AA中的改变。2通过检测AA患儿T细胞内调控因子GAS5的表达水平,初步探讨GAS5与MTOR信号途径的关系。3从T细胞的胞内信号转导途径上,初步探讨儿童AA的免疫学发病机制。方法1用流式细胞术(FCM)方法检测16例初治SAA及8例免疫抑制剂治疗(IST)有效SAA患儿外周血CD3T细胞内MTOR信号途径分子磷酸化AKT(PAKT)、磷酸化TSC2(PTSC2)、磷酸化MTOR(PMTOR)、磷酸化4EBP1(P4EBP1)及磷酸化P70S6K(PP70S6K)的表达水平。2用实时定量聚合酶连反应(RTPCR)方法检测23例初治SAA及7例IST有效SAA患儿骨髓CD3T细胞内调控因子GAS5的表达水平。结果1初治SAA组外周血CD3T淋巴细胞内PAKT、PTSC2、PMTOR、P4EBP1及PP70S6K表达水平均明显高于正常对照组(P<005),而低于阳性对照CEM细胞株组(P<005),初治SAA组、正常对照组及CEM组PAKT的平均荧光强度(MFI)分别为(804378)、(259101)、(2023898),PTSC2分别为(49731949)、(1610804)、(101052978),PMTORC1分别为(1390932)、(292109)、(3431903),P4EBP1分别为(142695336)、(26911370)、(256015379),PP70S6K分别为(17671048)、(369222)、(31731285)。2SAA治疗有效组外周血CD3T淋巴细胞内PAKT、PTSC2、PMTOR、P4EBP1及PP70S6K的表达水平均低于初治SAA组(P<005);SAA治疗有效组PAKT、PTSC2、PMTORC1、P70S6K的表达水平与正常对照组无明显差异(P均>005),但P4EBP1的表达水平高于正常对照组(P<005),治疗有效组信号途径分子的表达量依次为(328127)、(16501091)、(354166)、(74894969)、(421169)。3初治SAA组骨中文摘要MTOR信号途径在儿童再生障碍性贫血T细胞中异常活化的初步研究II髓CD3T淋巴细胞内GAS5的表达量明显低于正常对照组(P<005),而显著高于CEM组(P<005),三组GAS5的表达量分别为(413274)、(1114486)、(159088)。4治疗有效组骨髓CD3T淋巴细胞内GAS5的表达水平高于初治SAA组(P<005),而与正常对照组无明显差异(P>005),表达量为(892353)。结论1初治SAA患儿外周血T细胞中PAKT、PTSC2、PMTOR、P4EBP1、PP70S6K表达升高,表明MTOR信号途径在SAA患儿中呈活化状态。2SAA治疗有效患儿外周血T细胞中PAKT、PTSC2、PMTOR、P4EBP1、PP70S6K表达低于初治SAA患儿,MTOR信号途径的活化程度与疾病状态相关,说明该信号途径可能参与AA的T细胞的免疫异常。3初治SAA患儿骨髓T细胞内GAS5表达水平明显低于正常儿童而显著高于CEM细胞,SAA治疗有效后GAS5表达水平明显升高,GAS5的表达水平可能与MTOR信号途径的活化存在一定负相关。GAS5可能为负性调控因子。关键词再生障碍性贫血;T细胞;MTOR;信号途径;GAS5作者孙豫兰指导老师何海龙副教授STUDYONTHEABNORMALACTIVATIONOFMTORSIGNALINGPATHWAYINTCELLSINCHILDHOODAPLASTICANEMIAABSTRACTIIISTUDYONTHEABNORMALACTIVATIONOFMTORSIGNALINGPATHWAYINTCELLSINCHILDHOODAPLASTICANEMIAABSTRACTOBJECTIVE1TOSUDYTHECHANGESOFMTORSIGNALINGPATHWAYINCHILDHOODAPLASTICANEMIABYDETECTINGTHEEXPRESSIONLEVELSOFTHEMOLECULESOFMTORSIGNALINGPATHWAYINTCELLS2TOEXPLORETHERELATIONSHIPBETWEENGAS5ANDMTORSIGNALINGPATHWAYBYDETECTINGTHEEXPRESSIONLEVELOFGAS5INTCELLSINCHILDRENWITHAA3TOEXPLOREIMMUNOLOGOICALPATHOGENESISOFAAINCHILDRENFROMTCELLINTRACELLULARSIGNALTRANSDUCTIONPATHWAYMETHOD1THEEXPRESSIONSOFPAKT,PTSC2,PMTOR,P4EBP1,PP70S6KINCD3TCELLSINPERIPHERALBLOODWEREDETECTEDBYFLOWCYTOMETRYFCMSAMPLESWERECOLLECTDFROM16NEWLYDIAGNOSEDSEVERAPLASTICANEMIASAAPATIENTSAND8PATIENSWITHEFFECTIVEIMMUNOSUPPRESSIVETHERAPYIST2THEEXPRESSIONSOFGAS5INCD3TCELLSINBONEMARROWMONNUCLEARWEREDETECTEDBYREALTIMEQUANTITATIVEPOLYMERASECHAINREACTIONRTPCRSAMPLESWERECOLLECTEDFROM23NEWLYDIAGNOSEDSAAPATIENTSAND7PATIENTSWITHEFFECTIVEISTRESULTS1THEEXPRESSIONSOFPAKT,PTSC2,PMTOR,P4EBP1,PP70S6KOFTHENEWLYDIAGNOSEDSAAGROUPWEREHIGHERTHANTHENORMALCONTROLGROUPP005,BUTWERELOWERTHANTHEPOSTIVECONTROLGROUPCEMGROUPP005THEMEANFLUORESCENCEINTENSITYMFIOFPAKTOFTHREEGROUPSWERERESPECTIVE804378,259101,2023898;PTSC2WERE49731949,1610804,101052978;PMTORWERE1390932,292109,3431903;P4EBP1WERE142695336,26911370,256015379;PP70S6KWERE17671048,369222,317312852THEEXPRESSIONSOFPAKT,PTSC2,PMTOR,P4EBP1,PP70S6KOFTHEEFFECTIVETREATMENTGROUPSWERELOWERTHANTHENEWLYDIAGNOSEDSAAGROUPP005;THEEXPRESSIONSOFPAKT,PTSC2,PMTOR,PP70S6KWERESIMILARTOTHENORMALCONTROLGROUPP005,BUTTHEEXPRESSIONSOFP4EBP1WEREHIGHERP005THEMFIWEREFOLLOWEDBY328127,16501091,354166,74894969,4211693THEEXPRESSIONSOFABSTRACTSTUDYONTHEABNORMALACTIVATIONOFMTORSIGNALINGPATHWAYINTCELLSINCHILDHOODAPLASTICANEMIAIVGAS5OFTHENEWLYDIAGNOSEDSAAGROUPWERELOWERTHANTHENORMALCONTROLGROUPP005,BUTWASHIGHERTHANCEMGROUPP005,THEEXPRESSIONSOFGAS5WEREFOLLOWEDBY413274,1114486,159088INTHETHREEGROUPS4THEEXPRESSIONSOFGAS5OFTHEEFFECTIVETREATMENTGROUPSWEREHIGHERTHANTHENEWLYDIAGNOSEDSAAGROUPP005,BUTWERESIMILARTOTHENORMALCONTROLGROUPP005,892353CONCLUSION1THEEXPRESSIONSOFPAKT,PTSC2,PMTOR,P4EBP1,PP70S6KWEREINCREASEDINTHENEWLYDIAGNOSEDSAAPATIENTS,THEMTORSIGNALINGPATHWAYWASACTIVATEDINSAAPATIENTS2THEEXPRESSIONSOFPAKT,PTSC2,PMTOR,P4EBP1,PP70S6KWERELOWERTHANTHENEWLYDIAGNOSEDSAAPATIENTSTHEDEGREEOFACTIVATIONOFMTORSIGNALINGPATHWAYWASASSOCIATEDWITHDISEASESTATESTHESIGNALINGPATHWAYSMAYBEINVOLVEDINTHETCELLSOFAAOFTHEIMMUNEABNORMALITIES3THEEXPRESSIONSSOFGAS5INTHENEWLYDIAGNOSEDSAAPATIENTSWERELOWERTHANNORMALCONTROL,BUTWEREHIGHERCEMCELLSTHEEXPRESSIONSOFGAS5WEREINCREASEDINTHEEFFECTIVETREATMENTOFCHILDRENWITHSAATHEEXPRESSIONSLEVELSOFGAS5MAYBENEGATIVELYCORRELATEDWITHTHEACTIVATIONOFMTORSIGNALINGPATHWAYKEYWORDSAPLASTIC,ANEMIA;TCELL;MTOR;SIGNALINGPATHWAY;GAS5WRITTENBYYULANSUNSUPERVISEDBYHAILONGHE目录引言1材料与方法5结果12讨论18结论23参考文献24综述26中英文对照缩略词表36攻读学位期间公开发表的论文38致谢39MTOR信号途径在儿童再生障碍性贫血T细胞中异常活化的初步研究引言1引言哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(MAMMALIANTARGETOFRAPAMYCIN,MTOR)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶,广泛存在于各种真核生物细胞中,它作为环境中央感受器,可整合氨基酸、能量、生长因子等多种信号,在调节细胞生长、分化及增殖中处于核心地位1。MTOR信号途径的活化已被证明与多种肿瘤性疾病的发生密切相关,是肿瘤靶向治疗的一个热点。最近,MTOR信号途径在调控T细胞分化和功能上的作用与地位也越来越受到重视,这对自身免疫性疾病具有非常重要的意义,已有报道证实系统性红斑狼疮(SYSTEMICLUPUSERYTHEMATOSUS,SLE)、Ⅰ型糖尿病、移植物抗宿主病的发病与MTOR信号途径异常活化有关15。MTOR信号途径上游信号主要包括氨基酸、ATP和各种生长因子,通过多条信号转导途径传递信号,其中最主要的信号转导途径之一为PI3K/AKT/MTOR,其与T细胞的活化密切相关。众所周知,T细胞的活化需要双信号的刺激,第一信号由TCR/CD3介导,第二信号主要由CD28/IL2介导2。T细胞活化过程中,磷脂酰肌醇3激酶(PHOSPHATIDYLINOSITOL3KINASE,PI3K)以酪氨酸磷酸酶化依赖的形式结合于CD28胞浆面,被激活的PI3K将信号传递至下游的AKT,活化的AKT(又称为蛋白激酶B)通过磷酸化结节性硬化复合物2(TUBEROUSSCLEROSISCOMPLEX2,TSC2)使TSC1/TSC2二聚体复合物解离。由于TSC1/TSC2二聚体复合物是MTOR的抑制剂,所以当AKT活化后通过磷酸化TSC2间接激活了MTORC1。MTORC1是MTOR在生物体主要存在的两种形式之一,其特有的结合蛋白为RACTOR,主要功能是调节蛋白质合成和细胞的增殖、存活等;另一种形式为MTOR2,其特有的结合蛋白为RICTOR,主要在肌动蛋白细胞骨架组织和细胞存活方面发挥重要作用3。最近的研究发现两者对T细胞的的作用也有所不同,MTORC1主要影响TH1和TH17细胞的分化,MTORC2主要影响TH17细胞的分化,而两者共同决定TREG细胞的分化4。MTOR信号途径的上游活化后可进一步激活下游的分子,MTOR的底物中研究最为广泛的是真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白EUKARYOTICINITIATIONFACTOR4EBINDINGPROTEIN,4EBP1和核糖体40S小亚基S6蛋白激酶(P70S6K)。4EBP1通过与真核细胞翻译起始因子4E(EUKARYOTICINITIATIONFACTOR,EIF4E)的结合,抑制三聚体复合物EIF4F引言MTOR信号途径在儿童再生障碍性贫血T细胞中异常活化的初步研究2的形成,从而抑制核糖体与MRNA结合进行蛋白质的翻译。MTOR信号途径活化使4EBP1磷酸化而失去与EIF4E的结合能力,间接上调MRNA翻译水平,促进蛋白质合成5。被激活的P70S6K可磷酸化核糖体40S小亚基S6蛋白,使40S小亚基与核糖体结合,促进5’末端含寡聚嘧啶的MRNA(5’TERMINALOLIGOPYRIMIDINETRACT,5’TOP)的翻译6。MTOR信号途径通过4EBP1和P70S6K从翻译水平上对细胞的增殖进行调控。在T细胞双信号活化的模式下,MTOR信号途径可整合免疫环境信号对T细胞活化和分化进行调控。研究表明MTOR信号途径活化可促进初始CD4T细胞分化为TH1细胞,使CD8T细胞分化为细胞毒性T淋巴细胞(CTL),且当使用雷帕霉素抑制该信号途径的活性时,TCR介导的第一信号非但不能激活T细胞,反而导致T细胞无能7。敲除MTOR基因的小鼠,初始CD4T细胞失去分化为TH1、TH2及TH17的能力,而分化TREG细胞8。可见MTOR信号途径与T细胞的代谢和功能直接关联并起着核心作用。GAS5GROWTHARRESTSPECIFICTRANSCRIPT5基因是SCHNEIDER等从减法CDNA文库中发现,定位于人类染色体1Q25,它的内含子编码SNORNAS,外显子包含一个小的开放性阅读框架,而不编码功能性蛋白9。GAS5的表达在细胞生长抑制和凋亡中具有非常重要的作用。实验发现,使用小干扰RNA(SIRNA)干扰CEM细胞(已证实其内MTOR信号途径活化)中GAS5的表达时,CEM细胞增殖加快,细胞周期明显缩短。GAS5转染CEM细胞96小时后,CEM细胞的凋亡则明显增加,处于G0期的细胞比例上升10、11。且当CEM细胞中GAS5表达下调时,MTOR的特异性抑制剂雷帕霉素对CEM细胞增殖的抑制作用也大大减弱10。提示GAS5可能对MTOR信号途径有潜在的负性调控作用,表达上调时抑制MTOR信号途径的活性,调控CEM细胞的增殖。再生障碍性贫血(APLASTICANEMIA,AA)是一种骨髓造血功能衰竭性疾病,是儿童期较为常见且严重的血液病之一,临床常表现为贫血、出血和感染以及相关症候群。其发病机制尚不明确,一般认为包括三个方面造血干(祖)细胞缺陷、异常免疫反应和造血微环境功能缺陷。近年来,关于AA免疫学发病机制的研究发展非常迅速,大量的基础及临床研究表明,AA患儿体内的T细胞处于异常激活的状态,通过产生过量的负性造血调控因子,如IL2、TNFΑ、ΓIFN等,损伤造血干/祖细胞,进而导致骨髓衰竭。TH1和TH2细胞比例失衡、TH1细胞功能亢进、CD8效应T淋巴细胞增多,以及TREG细胞数量减少,免疫耐受破坏在AA的发病机制中都具有重要意义12。临床上应用免疫抑制剂,如抗淋巴细胞球蛋白/抗胸腺细胞球蛋白(ALG/ATG)、环孢素A(CSA),大大改善了AA的生存情况,ATG联合CSA治疗儿童SAA的总体有效率达MTOR信号途径在儿童再生障碍性贫血T细胞中异常活化的初步研究引言3到了80左右13,也是AA免疫学发病机制的有力证据。因此,越来越多的学者认为AA是T淋巴细胞介导的以造血组织为靶器官的自身免疫性疾病。目前对AA免疫学发病机制的研究大多关注于初始T细胞、效应T细胞、调节T细胞及负性造血调控因子间的关系,而对胞内调节T细胞活化的信号途径很少关注。那么AA患者体内T细胞稳态的破坏是否与MTOR信号途径的活化有关MTOR信号途径的活化是否与GAS5的表达下调有关该方面相关的研究报道甚少。本研究旨在通过检测AA患儿外周血T细胞中MTOR信号途径上游分子AKT、TSC2、MTOR,下游分子4EBP1、P70S6K的磷酸化水平及骨髓T细胞中调控因子GAS5的表达水平,研究该信号途径在儿童AA中的改变,初步探讨MTOR信号途径与AA免疫学发病机制的关系。参考文献1KEITH,CT,SCHREIBER,SLPIKRELATEDKINASESDNAREPAIR,RECOMBINATION,ANDCELLCYCLECHECKPOINTSJSCIENCE,1995,27050512金伯泉,熊思东医学免疫学M北京人民卫生出版社,20081041073CARSONCTHOREEN,SEONGAKANGETALANATPCOMPETITIVEMTORINHIBITORREVEALSRAPAMYCININSENSITIVEFUNCTIONSOFMTORC1JJBIOCHEM,2009,284,802380324CHIHONGBOREGULATIONANDFUNCTIONOFMTORSIGNALLINGINTCELLFATEDECISIONJNATREVIMMUNOL,2012,1253253385GINGRASAC,RAUGHTB,SONENBERGNEIF4EINITIATIONFACTORSEFFECTORSOFMRNARECRUITMENTTORIBOSOMESANDREGULATORSOFTRANSLATIONJANNUREVBIOCHEM,1999,689139636INOKIK,OUYANGH,LIY,ETALSIGNALINGBYTARGETOFRAPAMYCINPROTEINSINCELLGROWTHCONTROLJMICROBIOLMOLBIOLREV,2005,691791007JONATHANDPOWELL,GREGMDELGOFFETHEMAMMALIANTARGETOFRAPAMYCINMTORPROVIDESACRITICALLINKBETWEENTCELLDIFFERENTIATION,FUNCTIONANDMETABOLISMJIMMUNITY,2010,3333013118SCHNEIDER,C,KING,RM,PHILIPSON,LGENESSPECIFICALLYEXPRESSEDATGROWTHARRESTOFMAMMALIANCELLSJCELLSCIENCE,1988,54,7877939DELGOFFEGM,POLLIZZIKN,WAICKMANAT,ETA1THEKINASEMTORREGULATESTHEDIFERENTIATIONOFHELPERTCELLSTHROUGHTHESELECTIVEACTIVATIONOFSIGNALINGBYMTORC1ANDMTORC2JNATIMMUNOL,2011,124295303
编号:201403192117530456    类型:共享资源    大小:1.12MB    格式:PDF    上传时间:2014-03-19
  
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