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硕士学位论文 论文题目 mTOR 信号途径在儿童再生障碍性贫血 T 细胞中异常活化的初步研究 研究生姓名 孙豫兰 指导教师姓名 何海龙 专 业 名 称 儿科学 研 究 方 向 小儿血液与肿瘤 论文提交日期 2013 年 3 月 mTOR 信号途径在儿童再生障碍性贫血 T 细胞中异常活化的初步研 究 中文摘要 I mTOR 信号途径 在儿童再生障碍性贫血 T 细胞中 异常活化的初步研究 中文摘要 目的: 1.通过检测再生障碍性贫血( AA)患儿 T 细胞内 mTOR 信号途径分子的表达水平 ,研究该信号途径在儿童 AA 中的改变。 2.通过检测 AA 患儿 T 细胞内 调控因子 GAS5 的表达水平 ,初步探 讨 GAS5 与 mTOR 信号途径的关系。 3.从 T 细胞 的胞内信号转导途径上,初步探讨儿童 AA 的免疫学发病机制。 方法: 1.用流式细胞术( FCM)方法检测 16例初治 SAA及 8例免疫抑制剂治疗( IST)有效 SAA患儿外周血 CD3+T细胞内 mTOR信号途径分子磷酸化 Akt( p-Akt)、磷酸化TSC2( p-TSC2)、磷酸化 mTOR( p-mTOR)、磷酸化 4EBP1( p-4EBP1)及磷酸化p70S6K( p-p70S6K)的表达水平。 2.用实时定量聚合酶连反应( RT-PCR)方法检测23例初治 SAA及 7例 IST有效 SAA患儿骨髓 CD3+T细胞内 调控因子 GAS5的表达水平。 结果: 1.初治 SAA组外周血 CD3+T淋巴细胞内 p-Akt、 p-TSC2、 p-mTOR、 p-4EBP1及 p-p70S6K表达水平 均 明显高于正常对照组( P 0.05),而低于 阳性对照 CEM细胞株 组( P 0.05),初治 SAA组、正常对照组及 CEM组 p-Akt的平均荧光强度( MFI)分别为( 8.043.78)、( 2.591.01)、( 20.238.98), p-TSC2分别为( 49.7319.49)、( 16.108.04)、( 101.0529.78), p-mTORC1分别为( 13.909.32)、( 2.92 1.09)、( 34.319.03), p-4EBP1分别为( 142.6953.36)、( 26.9113.70)、( 256.0153.79),p-p70S6K分别为 ( 17.67 10.48)、( 3.69 2.22)、( 31.73 12.85)。 2.SAA治疗有效组外周血 CD3+T淋巴细胞内 p-Akt、 p-TSC2、 p-mTOR、 p-4EBP1及 p-p70S6K的表达水平 均低于初治 SAA组( P 0.05); SAA治疗有效组 p-Akt、 p-TSC2、 p-mTORC1、p70S6K的表达水平与正常对照组无明显差异( P均 0.05),但 p-4EBP1的表达水平高于正常对照组( P 0.05),治疗有效组信号途径分子的 表达量依次为( 3.281.27)、( 16.5010.91)、( 3.541.66)、( 74.8949.69)、( 4.211.69)。 3.初治 SAA组骨中文摘要 mTOR 信号途径在儿童再生障碍性贫血 T 细胞中异常活化的初步研究 II 髓 CD3+T淋巴细胞内 GAS5的表达量明显低于正常对照组( P 0.05),而显著高于 CEM组( P 0.05),三组 GAS5的表达量分别为( 4.132.74)、( 11.144.86)、( 1.590 .88)。4.治疗有效组骨髓 CD3+T淋巴细胞内 GAS5的表达水平高于初治 SAA组( P 0.05),而与正常对照组无明显差异( P 0.05),表达量为 ( 8.923.53) 。 结论: 1.初治 SAA患儿外周血 T细胞中 p-Akt、 p-TSC2、 p-mTOR、 p-4EBP1、p-p70S6K表达升高, 表明 mTOR信号途径在 SAA患儿中呈活化状态。 2.SAA治疗有效患儿外周血 T细胞中 p-Akt、 p-TSC2、 p-mTOR、 p-4EBP1、 p-p70S6K表达低于初治 SAA患儿, mTOR信号途径的活 化程度与疾病状态相关, 说明 该信号途径可能参与 AA的 T细胞的免疫异常。 3.初治 SAA患儿骨髓 T细胞内 GAS5表达水平明显低于正常 儿童 而显著高于 CEM细胞 , SAA治疗有效后 GAS5表达水平明显升高, GAS5的表达水平可能与 mTOR信号途径的活化存在一定负相关。 GAS5可能为负性调控因子。 关键词 :再生障碍性贫血; T细胞; mTOR;信号途径; GAS5 作 者 :孙豫兰 指导老师 :何海龙 副教授 Study on the abnormal activation of mTOR signaling pathway in Tcells in childhood aplastic anemia Abstract III Study on the abnormal activation of mTOR signaling pathway in Tcells in childhood aplastic anemia Abstract Objective: 1.To sudy the changes of mTOR signaling pathway in childhood aplastic anemia by detecting the expression levels of the molecules of mTOR signaling pathway in T cells. 2.To explore the relationship between GAS5 and mTOR signaling pathway by detecting the expression level of GAS5 in T cells in children with AA. 3.To explore immunologoical pathogenesis of AA in children from T cell intracellular signal transduction pathway. Method: 1.The expressions of p-Akt,p-TSC2,p-mTOR,p-4EBP1,p-p70S6K in CD3+ T cells in peripheral blood were detected by flow cytometry(FCM).Samples were collectd from 16 newly diagnosed sever aplastic anemia(SAA) patients and 8 patiens with effective immunosuppressive therapy(IST). 2.The expressions of GAS5 in CD3+T cells in bone marrow monnuclear were detected by real time quantitative polymerase chain reaction(RT-PCR).Samples were collected from 23 newly diagnosed SAA patients and 7 patients with effective IST. Results: 1.The expressions of p-Akt,p-TSC2,p-mTOR,p-4EBP1,p-p70S6K of the newly diagnosed SAA group were higher than the normal control group(P0.05),but were lower than the postive control group(CEM group) (P0.05).The mean fluorescence intensity(MFI) of p-Akt of three groups were respective (8.043.78),(2.591.01), (20.238.98);p-TSC2 were (49.7319.49),(16.108.04),(101.0529.78);p-mTOR were (13.909.32),(2.92 1.09),(34.319.03);p-4EBP1 were (142.6953.36), (26.91 13.70),(256.0153.79);p-p70S6K were (17.6710.48),(3.692.22),(31.7312.85). 2. The expressions of p-Akt,p-TSC2,p-mTOR,p-4EBP1,p-p70S6K of the effective treatment groups were lower than the newly diagnosed SAA group(P0.05),but the expressions of p-4EBP1 were higher(P0.05).the MFI were followed by (3.281.27),(16.5010.91),(3.541.66),(74.8949.69),(4.211.69). 3.The expressions of Abstract Study on the abnormal activation of mTOR signaling pathway in Tcells in childhood aplastic anemia IV GAS5 of the newly diagnosed SAA group were lower than the normal control group(P0.05),but was higher than CEM group(P0.05),the expressions of GAS5 were followed by (4.132.74),(11.144.86),(1.590 .88) in the three groups. 4.The expressions of GAS5 of the effective treatment groups were higher than the newly diagnosed SAA group(P0.05),( 8.923.53). Conclusion: 1.The expressions of p-Akt,p-TSC2,p-mTOR,p-4EBP1,p-p70S6K were increased in the newly diagnosed SAA patients,the mTOR signaling pathway was activated in SAA patients. 2. The expressions of p-Akt,p-TSC2,p-mTOR,p-4EBP1,p-p70S6K were lower than the newly diagnosed SAA patients.the degree of activation of mTOR signaling pathway was associated with disease states.The signaling pathways may be involved in the T cells of AA of the immune abnormalities. 3.The expressionss of GAS5 in the newly diagnosed SAA patients were lower than normal control,but were higher CEM cells.The expressions of GAS5 were increased in the effective treatment of children with SAA.The expressions levels of GAS5 may be negatively correlated with the activation of mTOR signaling pathway. Key words: aplastic,anemia; T cell; mTOR; signaling pathway;GAS5 Written by: Yu-lan Sun Supervised by: Hai-long He 目 录 引 言 . 1 材料与方法 . 5 结 果 . 12 讨 论 . 18 结 论 . 23 参考文献 . 24 综 述 . 26 中英文对照缩略词表 . 36 攻读学位期间公开发表的论文 . 38 致 谢 . 39 mTOR 信号途径在儿童再生障碍性贫血 T 细胞中异常活化的初步研究 引 言 1 引 言 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白( mammalian target of rapamycin , mTOR)是一种高度保守的丝氨酸 /苏氨酸激酶,广泛存在于各种真核生物细胞中,它作为环境中央感受器,可整合氨基酸、能量、生长因子等多种信号,在调节细胞生长、分化及增殖中处于核心地位 1。 mTOR信号途径的活化已被证明与多种肿瘤性疾病的发生密切相关,是肿瘤靶向治疗的一个热点。最近, mTOR信号途径在调控 T细胞分化和功能上的作用与地位也越来越 受到重视, 这对自身免疫性疾病具有非常重要的意义 , 已有报道证实系统性红斑狼疮( systemic lupus erythematosus , SLE)、型糖尿 病、移植物抗宿主病的发病与 mTOR信号途径异常活化有关 15。 mTOR信号途径上游信号主要包括氨基酸、 ATP和各种生长因子 ,通过多条信号转导途径传递信号,其中最主要的 信号转导途径 之一 为 PI3K/Akt/mTOR,其与 T细胞的活化密切相关。众所周知, T细胞的活化需要 双信号的刺激,第一信号由 TCR/CD3介导,第二信号主要由 CD28/IL2介导 2。 T细胞活化过程中, 磷脂酰肌醇 3激酶( phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K) 以酪氨酸磷酸酶化依赖的形式结合于 CD28胞浆面,被激 活的 PI3K将信号传递至下游的 Akt,活化的 Akt( 又称为 蛋白激酶 B) 通过磷酸化 结节性 硬化复合物 -2( tuberous sclerosis complex 2, TSC2) 使 TSC1/TSC2二聚体复合物解离。由于 TSC1/TSC2二聚体复合物是 mTOR的抑制剂,所以当 Akt活化后通过磷酸化 TSC2间接激活了 mTORC1。 mTORC1是 mTOR在生物体主要存在的两种 形式 之一 , 其 特有的结合蛋白为 Ractor, 主要功能是调节蛋白质合成和细胞的增殖、存活等;另 一种形式为 mTOR2, 其 特有的结合蛋白为 Rictor, 主 要 在肌动蛋白细胞骨架组织和细胞存活方面发挥重要作用 3。 最近的 研究发现 两者对 T细胞的的作用也有所不同, mTORC1主要影响 Th1和 Th17细胞的分化, mTORC2主要影响 Th17细胞的分化,而两者共同决定 Treg细胞的分化 4。 mTOR信号途径的上游活化后可进一步激活下游的分子, mTOR的底物中 研究最为广泛的是真核细胞翻译起始因子 4E结合蛋白 (eukaryotic initiation factor 4E-binding protein, 4EBP1 )和核糖体 40S小亚基 S6蛋白激酶( p70S6K)。 4EBP1通过与 真核细胞翻译起始因子 4E( eukaryotic initiation factor, eIF4E) 的结合,抑制三聚体复合物 eIF4F引 言 mTOR 信号途 径在儿童再生障碍性贫血 T 细胞中异常活化的初步研究 2 的形成,从而抑制核糖体与 mRNA结合进行蛋白质的翻译。 mTOR信号途径活化使4EBP1磷酸化而失去与 eIF4E的结合能力,间接上调 mRNA翻译水平,促进蛋白质合成 5。被激活的 p70S6K可磷酸化核糖体 40S小亚基 S6蛋白,使 40S小亚基与核糖体结合,促进 5末端含寡聚嘧啶的 mRNA( 5 terminal oligopyrimidine tract, 5TOP)的翻译 6。 mTOR信号途径通过 4EBP1和 p70S6K从翻译水平上对细胞的增殖进行调控 。 在 T细胞双信号活化的模式下, mTOR信号途径可整合免疫环境信 号 对 T细胞活化和分化进行调控。 研究表明 mTOR信号途径活化可促进初始 CD4+T细胞分化为 Th1细胞,使 CD8+T细 胞分化为 细胞毒性 T淋巴细胞( CTL) ,且当使用雷帕霉素抑制该信号途径的活性时, TCR介导的第一信号非但不能激活 T细胞 , 反而导致 T细胞无能 7。敲除 mTOR基因的小鼠,初始 CD4+T细胞失去分化为 Th1、 Th2及 Th17的能力,而分化 Treg细胞 8。可见 mTOR信号途径与 T细胞的代谢和功能直接关联并起着核心作用。 GAS5 (Growth-Arrest-Specific Transcript 5)基因 是 Schneider等从减法 cDNA文库中发现,定位于人类染色体 1q25,它的内含子编码 snoRNAs,外显子包含一个小的开放 性 阅读框架,而不编码功能性蛋白 9。 GAS5的表达在细胞生长抑制和凋亡中具有非常重要的作用 。 实验发现,使用 小干扰 RNA( siRNA) 干扰 CEM细胞(已证实其内mTOR信号途径活化) 中 GAS5的表达时, CEM细胞增殖加快 ,细胞周期明显缩短。GAS5转染 CEM细胞 96小时后, CEM细胞的凋亡则明显增加,处于 G0期的细胞比例上升 10、 11。 且当 CEM细胞中 GAS5表达下 调时, mTOR的 特异性 抑制剂 雷帕霉素 对 CEM细胞 增殖 的抑制作用也 大大减弱 10。 提示 GAS5可能对 mTOR信号途径有潜在的负性调控作用,表达上调时抑制 mTOR信号途径的活性,调控 CEM细胞的增殖。 再生障碍性贫血( aplastic anemia, AA)是 一种骨髓造血功能衰竭性疾病 , 是 儿童期较为常见且严重的血液病之一, 临床常表现为贫血、出血和感染 以及相关症候 群 。其发病机制 尚不明确 , 一般认为 包括三个方面:造血干(祖)细胞缺陷、异常免疫反应和造血微环境功能缺陷。 近年来,关于 AA免疫学发病机制的研究发展非常迅速,大量的基础及临床研究表明, AA患儿体内的 T细胞处于异常激活的状态,通过产生过量的负性造血调控因子,如 IL-2、 TNF-、 -IFN等 ,损伤造血干 /祖细胞,进而导致骨髓衰竭。 Th1和 Th2细胞比例失衡、 Th1细胞功能亢进、 CD8+效应 T淋巴细胞增多,以及 Treg细胞数量减少,免疫耐受破坏在 AA的发病 机制中都具有重要意义 12。临床上应用免疫抑制剂,如抗淋巴 细胞球蛋白 /抗胸腺细胞球蛋白( ALG/ATG)、环孢素A( CsA),大大改善了 AA的生存情况, ATG联合 CsA治疗儿童 SAA的总体有效率达mTOR 信号途径在儿童再生障碍性贫血 T 细胞中异常活化的初步研究 引 言 3 到了 80%左右 13,也是 AA免疫学发病机制的有力证据。因此,越来越多的学者认为AA是 T淋巴细胞介导的以造血组织为靶器官 的自身免疫性疾病 。 目前对 AA免疫学发病机制的研究大多关注于 初始 T细胞、效应 T细胞、调节 T细胞 及负性造血调控因子 间的关系,而对胞内调节 T细胞活化的信号途径很少关注。 那么 AA患者体内 T细胞稳态的破坏是否 与 mTOR信号途径的活化有关? mTOR信号途径的活化 是否与 GAS5的表达下调有关? 该方面 相关的研究报道 甚少。 本研究旨在通过检测 AA患儿外周血 T细胞中 mTOR信号途径上游分子 Akt、 TSC2、 mTOR,下游分子4EBP1、 p70S6K的磷酸化水平及骨髓 T细胞中 调控因子 GAS5的表达水平,研究该信号途径在儿童 AA中的改变 ,初步探讨 mTOR信号途径与 AA免疫学发病机制的关系。 参考文献 1. Keith,C.T.,Schreiber,S.L.PIK-related kinases:DNA repair,recombination,and cell cycle checkpointsJ.Science,1995,270:50-51. 2. 金伯泉 ,熊思东 .医学免疫学 M.北京 :人民卫生出版社 ,2008:104-107. 3. Carson C.Thoreen, Seong A.Kang et al. An ATP-competitive mTOR inhibitor reveals rapamycin-insensitive functions of mTORC1J.J Bio Chem,2

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