T-SPOT

结核感染T细胞斑点试验的临床应用,结核感染诊断现状,结核菌素皮试（TST）是长期以来用以快速诊断结核感染的唯一手段。TST缺陷低特异性低敏感性主观依赖性导致局部炎症及疤痕,主要内容,原理结果的判断临床应用评价,一、T-SPOT.TB的原理,结核分枝杆菌感染机体后被巨噬细胞吞噬，但不能完全将其清除，巨噬细胞凋亡后释放出大量特异性抗原，并递呈给特异性的CD4、CD8T细胞，使其激活并释放大量-干扰素。大量研究表明结核抗原特异分泌-干扰素的T 细胞可作为结核分枝杆菌感染的一种可靠标志物。,一、T-SPOT.TB的原理,酶联免疫斑点技术（ELISPOT）是近20年发展起来的检测抗原特异性T细胞的技术，是目前最敏感的检测抗原特异性T细胞的方法之一，可以检测出1/10万1/5万外周血单个核细胞中经过某种抗原刺激后释放某种细胞因子的细胞，经过酶联显色后，通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数1个斑点代表1个细胞，从而计算出抗原特异性细胞的频率。,一、T-SPOT.TB的原理,Behr应用基因芯片计数比较结核分枝杆菌标准株H37Rv和BCG的全基因组，结果显示129个只特定存在于结核分支杆菌而BCG中缺失的开放读码框，命名为RD1-RD16，其中RD1包含9个开放读码框被证实所有的BCG中均不存在，因此最具有编码特异性抗原的潜质。,一、 T-SPOT.TB的原理,Lalvani建立以RDI编码的结核特异性抗原6KD早期分泌靶向抗原和10KD培养滤过蛋白肽段库为刺激源，检测外周血中结核特异性释放干扰素的T淋巴细胞。,二、结果的判断,试验分四组：空白对照组、抗原组(ESAT-6和CFP-10)、阳性对照组(植物血凝素PHA)。通常正常结果，空白对照孔没有或有很少的斑点而PHA对照孔斑点数超过20个。 空白对照孔斑点数超过10个时结果被认为是“不确定”。当PHA对照孔斑点数少于20个时，检测结果被认为是“不确定”。当空白对照孔斑点数为0-5个并且（抗原A或抗原B斑点数）减去（空白对照孔斑点数）等于5-7时，此结果被认为是“灰区”，应当利用所有可利用相关的的临床信息进行判断。必要时可进行复查。T-SPOT.TB的实验结果也有用每106 PBMCs中斑点形成细胞(SFCs)的数目来描述，即SFCs106PBMCs。,二、结果的判断,如果抗原A和/或抗原B有应答，检测结果为“有反应性”，参照以下标准：空白对照孔斑点数为0-5个时且（抗原A或抗原B孔的斑点数）-（空白对照孔斑点数）6；空白对照孔斑点数为6-10个时且（抗原A或抗原B孔的斑点数）2（空白对照孔斑点数）；检测结果为“无反应性”：不符合上述标准且PHA对照孔正常。当PHA对照孔结果为“不确定”且抗原A和抗原B孔结果都为“无反应性”时，该实验结果被认为是“并不确定”，应当复查。“有反应性”结果表明样本中存在针对结核杆菌特异的效应T细胞“无反应性”结果表明样本中可能不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞,二、结果的判断(影响因素分析),既往结核病史或影像学提示陈旧性肺结核、有结核密切接触史或高潜伏性结核感染率可使其诊断活动性结核病的特异性降低。只与外周血中结核特异性抗原刺激产生的效应T细胞有关，与感染部位无关。与年龄、机体免疫状态、HIV感染、营养不良的程度无关。抗结核治疗后效应T细胞消失，可使斑点数减少或使结果呈阴性。与是否排菌无关。,三、临床应用,活动性结核与潜伏性结核感染的鉴别 “菌阴”结核患者的辅助诊断 肺外结核的鉴别诊断 结核发病风险的预测免疫力低下或受抑制患者的结核病诊断 区别结核感染者与BCG接种者 抗结核疗效的监测,四、评价（优点）,敏感性及特异性高：不受卡介苗接种及环境分枝杆菌影响，不受机体免疫状态影响。应用广泛：在活动性肺结核、肺外结核、结核性浆膜炎、潜伏性结核感染及免疫抑制的结核患者均能检测。诊断快速：24小时可报告结果。可进行疗效评估：治疗有效则T-SPOT.TB斑点数减少甚至阴性。,四、评价（弊端）,目前尚无统一的界值用来鉴别潜伏结核感染及活动性肺结核。在 5岁儿童、近期暴露于结核杆菌者、免疫功能低下者和需要二次检测者中使用的证据不足。对标本要求高：室温保存和运输血液样本（18-25），不能冷冻或冷藏；血液样本从采集到检测不超过8小时。结果需结合临床和其它检测进行判断，阴性结果不能排除暴露或感染结核杆菌的可能性。不能确定病变部位。,国外文献报道应用ELISPOT方法检测活动性肺结核的敏感性可达到 78% 100%, 特异性可达到80% 100%。国内学者研究应用ELISPOT方法检测活动性肺结核的敏感性为83%98.8%，特异性65%100%，阴性预测值81.891.6%，阳性预测值45.367.9%。,有学者指出：,诊断活动性结核病患者外周血T-SPOT.TB斑点形成细胞中位数为442SFCs/106 PBMC 。排除活动性结核病患者外周血T-SPOT.TB斑点形成细胞中位数为124SFCs/106 PBMC。以72SFCs/106 PBMC为界值时,诊断活动性结核病的敏感性为71.9%,特异性76.4%,ROC曲线下面积为0.810。以652SFCs/106PBMC为界值时,诊断活动性结核病的特异性达95%。,潜伏结核感染（LTBI）,宿主感染结核分枝杆菌后尚未发病、无活动性结核的临床表现、影像学改变或细菌学证据的一种特殊状态。潜伏性感染者如不进行治疗，约有5-10%会发展成活动性结核。T-SPOT.TB阳性与密切接触有更好的相关性，能更加准确地诊断LTBI。,潜伏性结核感染的斑点数有可能高于活动性结核，因此TSPOT.TB难以区分活动性结核和潜伏性结核感染。其原因可能有两点：(1)潜伏性结核感染者的免疫功能良好，少量的抗原刺激就激发出活跃的保护性免疫；(2)活动性结核患者免疫功能低下，大量的抗原刺激也不足以激