淋巴细胞分离

淋巴细胞的分离技术与培养,细胞分离原理与手段,基于对细胞物理特性 1 细胞比重差异（自然沉降法、密度梯度离心法、改变细胞密度法） 2 细胞的粘附性（贴壁细胞对玻璃、塑料器皿的粘附，B细胞对尼龙棉的粘附） 3 细胞对渗透压改变的敏感性（红细胞对低渗敏感，低渗处理，能使其裂解）基于细胞表面的特异性标志物 1 补体细胞毒分离法 2 免疫磁珠分离法 3 流式细胞术,血液细胞的组成及比重,外周血,红细胞,粒细胞,单个核细胞,血小板,单核细胞,1.093,1.0301.035,1.0751.090,(PBMC),1.092,单个核细胞的特点,单核细胞：贴壁生长，能吞噬羟基铁粉淋巴细胞：悬浮生长 1 粘附力：B细胞尼龙棉 2 细胞表面标志物 T细胞：CD2、CD3、CD4、CD8、CD25等 NK细胞：CD2、CD8、CD16、CD56等,淋巴细胞分离的流程,密度梯度离心法,粘附去除改变细胞密度法,E花环分离法尼龙棉分离法流式细胞术磁珠分离法,2,3,单个核细胞的分离 密度梯度离心法,原理： 外周血各种血细胞的比重不同，利用淋巴细胞分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 为此利用一种密度介于1.0751.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。,密度梯度离心法,Ficoll：1.0770.001 Percoll常用密度 20% 1.031 30% 1.043 40% 1.056 50% 1.067 60% 1.077 70% 1.090,细胞比重,分层液比重,离心后,PBMC,红细胞粒细胞,Ficoll/60% Percoll,稀释外周血,稀释的血浆、血小板,Ficoll/60% Percoll,实验步骤 1.采血，稀释 （外周血：稀释液=1：2）2.在离心管中加入分层液，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血 （Ficoll：稀释血=1：2）,3. 20，1500r/min，离心30min4. 沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min离心10min ，弃上清6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min，弃上清7.适量的培养基重悬细胞 ，计数8.细胞活性检测,1,淋巴细胞分离 吸附法和改变细胞密度法,单核细胞：贴壁生长，能吞噬羟基铁粉淋巴细胞不具有这些特点,粘附去除法,原理：单核细胞和粒细胞在37和Ca离子存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。方法：1、玻璃器皿吸附法 2 玻璃纤维柱法优点：简便易行，对细胞损伤极少。缺点：B细胞也有较弱的粘附能力，因此有部分B细胞丢失。 该法去除单核细胞后，大约95%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。,改变细胞密度法,原理：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大。方法一：磁铁吸引法方法二：羟基铁-乳胶分层液法,2,T、B、NK细胞的分离,T细胞能与STBC结合形成E花环E花环分离T细胞B细胞对尼龙纤维特有的吸附能力尼龙纤维分离B细胞淋巴细胞表面的标志差异免疫磁珠分离法与流式细胞术,E花环分离法,原理： 人类T细胞表面上有能与绵羊红细胞相结合的受体（E受体，CD2）,能与经2-氨乙基异硫溴化物（AET）处理的绵羊红细胞结合，形成稳定的、细胞体积和比重较大的E花环。,实验步骤,1 AET-E花环实验：将分离的单个核细胞（20万/ml)与等量的1%AET-SRBC混合，37水浴15min,每5min摇匀一次，然后分装，每管23ml，低速离心（1000r/min)5min后，4冰箱45分钟。2 T、B细胞分离： 淋巴细胞+SRBC悬液加入分层液T细胞形成E花环而沉于管底悬液中为B细胞。3 T细胞分离：取沉淀于管底的E花环，用Hanks液洗一次后，加双蒸水3ml处理3s，低渗裂解E-花环周围SRBC，立即加3.5%NaCl溶液1ml，使还原为等渗，低速离心沉淀，即的富含T淋巴细胞群。,试剂配制,AET溶液：称取AET粉剂402mg,溶于10ml去离子水中，用4mol/L NaOH溶液约910滴，调至pH9.0，用0.2m滤膜过滤除菌。用前临时配制。AET-SRBC的制备： 1 SRBC中加等渗盐溶液（1:4）， 1800r/min离心5min，连续洗涤5次 2 取压积的SRBC，加入新鲜配制的pH9.0的AET溶液（1:4），置37水浴15min，每隔5min摇匀一次。 3 加入预冷无菌等渗盐溶液，1800r/min离心5min，连续洗涤5次， 4 用含小牛血清的RPMI-1640液配成10% AET-SRBC悬液，置4保存，不得超过5天。使用时用10%小牛血清的RPMI-1640培养液稀释至1% ；,原理： B细胞在37时易粘附于尼龙棉（聚酰胺）纤维上，而T细胞不具此能力。方法： 淋巴细胞通过聚酰胺纤维管洗脱下来的是T细胞。,尼龙纤维分离法,磁珠分离法,原理：1 磁性微珠，可结合不同的生物大分子物质（抗原、抗体、核酸等）；2 在液相中，受外加磁场的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。 以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。基本步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。方式：阳性分离和阴性分离。阳性分离是直接从细胞混合液中分离出靶细胞，阴性分离是利用磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以分离,淋巴细胞的表面标志,CD抗原 特 异 性 CD2 E受体、全部T细胞和 部分NK细胞 CD3 成熟T细胞 CD4 Th细胞、M、HIV受体 CD8 Tc细胞、NK细胞的亚型 CD25 IL-2受体、活化T细胞 CD16、CD56 NK细胞,直接法对细胞进行分类,间接法对T细胞进行分离,阳性分选优点：纯度高，回收率高，操作迅速、简便。,阴极分选使用范围：1 去除不需要的细胞2 缺乏针对目的细胞的特异性抗体3不需要抗体和目的细胞结合4复合分选的一部分,实用范围：主要用于细胞亚群的分选或者得到高纯度非常稀有的细胞。主要方式：1 去除后再阳性分选细胞亚群的分选，可以先磁性标记非目的细胞，去除分选后对阴性组分再行磁性标记和阳性分选。2 多重分选多次阳性分选根据多种表面标志磁性分选细胞,复合分选,又叫荧光激活细胞分离法。原理： 细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区进行测定。当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴(4000个/s)，每小滴内最多含一个细胞，细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞的类型。,流式细胞术,激发系统,细胞分选系统,荧光激活细胞分离仪分离法,检测与讯号处理系统,细胞流动系统及气压流速控制系统,操作方法,1. 将分离的单个核细胞，用RPMI-1640培养基配成1107 /ml；2. 加适量荧光抗原（NK细胞特异性的抗原为CD16、CD56；T细胞CD3），4孵育30min，用RPMI-1640培养基洗2次；3. 用流式细胞仪进行分析。在散射光参数图上选取淋巴细胞群，在荧光参数图上选取绿色荧光阳性的细胞进行分选。,总结,T细胞分离 1 E花环分离取沉淀，低渗裂解，洗涤 2 磁珠分离法或流式细胞术B细胞分离 E 花环分离取上清，磁珠分离标记CD16或CD56NK细胞分离 E花环取上清或尼龙纤维分离液，磁珠或流式细胞术分离T细胞亚型分离T细胞分离的基础上，磁珠分离法或流式细胞术,淋巴细胞,淋巴细胞的培养,淋巴细胞的保存,（1）短期保存：用含有1020%灭活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI 1640培养液可保存数周。（2）长期保存：在保护剂二甲基亚砜中于液氮（-196)中保存。其过程是：先对需冻存的细胞作活细胞计数，低速离心后，取沉积细胞用含有10%二甲亚砜的小牛血清配制成适当浓度的细胞悬液，分装于冻存管内，4缓冲，-20结冰，转移 -80过夜，继而进行降温(-196)冷冻。（3）复苏：将其从液氮中取出，立即放入40 温水中，融化后加入10倍的培养液混匀，低速离心，洗去保护剂，再悬于新培养液中，计数并检查细胞活力。,淋巴细胞的培养,培养条件： （1）无菌 （2）恒温：培养箱的温度应严格控制在370.5 （3）气体环境：02和C02 。大多数细胞的适宜pH为7.27.4。 （4）培养液： RPMI1640培养基、培养用无机盐、胎牛血清(FCS)、HEPES、肝素、淋巴细胞分离液、植物凝集素(PHA)和白细胞介素等。,操作步骤：,1、洗涤 将收集到的淋巴细胞集中于离心管中用培养液洗涤两次，分别以2500和2000rpm离心各10min，弃上清，之后进行接种。2、细胞接种 细胞接种通常是在无菌室超净工作台内的酒精灯火焰区进行。3、摇床培养 将接种后的培养瓶放于CO2培养箱中培养，条件为37、5%CO2、饱和湿度。从72h开始每48h添加等体积的新鲜培养液。,细胞活力的测定台盼蓝染色法,原理 常用方法是台盼蓝染色法。这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，