梅毒诊断研究进展

梅毒诊断研究进展,He who knows syphilis,knows medicine,一、概述二、梅毒螺旋体三、梅毒四、梅毒的实验室诊断五、我国梅毒诊断试剂的现状六、中国药品生物制品检定所简介,一、概述,名 词,梅毒（Syphilis）由梅毒螺旋体感染引起的一种慢性全身性性传播疾病是我国卫生部规定的8种重点防治性病之一中华人民共和国传染病防治法规定的乙类传染病世界卫生组织列为世界上最常见的50种传染病之一 梅毒螺旋体（Treponema pallidum，TP ）是梅毒的病原体，因其透明，不易着色，故又称苍白螺旋体,溯 源,关于梅毒(syphilis)的起源和传播有很多争执 梅毒来源于美洲：有记载，1493年哥伦布发现新大陆，其水手从西印度群岛上感染了梅毒，1497年回到欧洲，其水手带回去的梅毒很快在欧洲广泛流行。亦有考证在美洲印地安人的骨骼上留有梅毒病损的遗迹1498年梅毒传到印度1510年传入日本，随后蔓延全世界。大约于1505年由印度传入我国广东，当时称为“广东疮”、“杨梅疮”，此后梅毒向内地传播解放前梅毒在我国的传播甚为广泛，一些大城市的发病率达，某些少数民族地区高达解放后，我国政府采取措施，只花费了十几年时间就控制了梅毒等性病的流行。尔后，撤销了大部分性病防治机构，医学院校也取消了性病课程，许多中青年医务人员压根儿就没见到过早期梅毒，至于一般年轻人甚至还没听说过这种病。 80年代初，梅毒和其他性传播疾病一样在我国死灰复燃，而且迅速蔓延,二、梅毒螺旋体,分类,螺旋体目（Spirochaetales）螺旋体科（Spirochaetaceae）密螺旋体属（Treponema）苍白螺旋体种（Treponema pallidum）分几个亚种,生物学特性形态学1,细长，5150.10.2um，形似细密的弹簧，螺旋弯曲规则，平均814个，两端尖直电镜下显示结构复杂，从外向内分为：外膜（主要由蛋白质、糖及类脂组成）、轴丝（主要由蛋白质组成）、圆柱形菌体（包括细胞壁、细胞膜及胞浆内容物）,生物学特性形态学2,透明不易染色，姬姆萨染色则可染成桃红色 在暗视野显微镜下观察，螺旋体浮游于组织中 有三种特征性的运动方式：旋转式，依靠自己的长轴旋转，向前后移动伸缩螺旋间距离活动，不断地拉长身体，使一端附着，再收缩旋距而前进；蛇行式，弯曲，像蛇爬行，是常见的方式,生物学特性形态学3,细胞质外有三层细胞质膜，有柔软而较坚固的粘蛋白包绕，以维持其一定的结构，外膜含有丰富的脂类及少量的蛋白6条内鞭毛围绕其内层细胞壁和外层细胞膜之间的空间旋转，是负责运动的收缩成分表面有特异性抗原，能刺激机体产生特异性的凝集抗体及密螺旋体制动或溶解抗体,繁 殖,繁殖方式与其生活环境有关近年来电子显微镜观察，在培养条件下或在体内适宜环境中为横断分裂，分裂时将躯干分裂成长短两段分裂增代时间为3033小时当条件不利时，以分芽子繁殖生活发育周期:颗粒期、球形体期及螺旋体期，与所致疾病周期、隐伏发作及慢性病程有关,培 养,一般不能人工培养Nichols株（有毒株）能接种在家兔睾丸中或眼前房内繁殖，能保持毒力转种至加有多种氨基酸的兔睾丸组织碎片的特殊培养基中，25厌氧环境下能使螺旋体保持运动能力4-7天1981年Fieldsteel等采用棉尾兔单层上皮细胞在1.5%氧的大气环境进行培养，经9-12天孵育后，螺旋体数比接种数平均增加49倍，对兔仍保持毒力Reiter株能生长繁殖，已丧失致病力Nichols株和Reiter株已广泛用作多种梅毒血清学的诊断抗原,生存条件,厌氧寄生物，在人体内可长期生存，体外不易生存干燥、肥皂水及一般消毒剂如1：1000苯酚、新洁尔灭、稀酒精均可于短时间将其杀死在血液中4经3日可死亡，故在血库冰箱冷藏3日以上的血液就无传染性温度的影响：41-42时可生活1-2小时，在48仅半小时即失去感染力，100立即死亡。对寒冷抵抗力大，在0时，可生活48小时，如将梅毒病损标本置于冰箱内，经1周仍可致病。在低温（-78）保存数年，仍可保持其形态、活动及毒性在封存的生理盐水稀释的组织液中可生活10小时左右在潮湿的器具或湿毛巾中，亦可生存数小时在干燥环境中可见迅速死亡,宿 主,梅毒螺旋体只感染人类人是梅毒的唯一传染源,毒力因子,目前未证明具有内毒素或外毒素粘多糖和粘多糖酶是其主要毒力因子 荚膜样的粘多糖能保护菌体免受环境中不良因素的伤害，在体内可阻止大分子物质（如抗体）穿透，从而保护菌体，还有抗吞噬作用 粘多糖酶与对组织细胞的吸附，对组织基质的分解和荚膜的合成有密切关系,致 病 性,由于其表面有赖以生存的荚膜样的粘多糖，荚膜中含有的N-乙酰-D-半乳糖胺，不能自行合成，须从宿主细胞获得其粘多糖酶吸附含粘多糖的组织细胞表面的粘多糖受体上，分解宿主细胞的粘多糖、获取合成荚膜所需的物质由于粘多糖是宿主组织和血管支架的重要基质成分，粘多糖被梅毒螺旋体分解后，组织受到损伤破坏，从而引起血管的塌陷，血供受阻，造成管腔闭合性动脉内膜炎，动脉周围炎及坏死，溃疡等病变,抗 原,分为三类：1表面特异性抗原：刺激机体产生特异凝集抗体及密螺旋体制动或溶解抗体，后者加补体可溶解螺旋体2螺旋体内类属抗原：可产生补体结合抗体，与非病原性螺旋体有交叉反应3，螺旋体与宿主组织磷脂形成的复合抗原：当螺旋体侵入组织后，组织中的磷脂可粘附在螺旋体上，形成复合抗原，此种复合抗原可刺激机体产生抗磷脂的自身免疫抗体，称为反应素（Aegagin），可与牛心肌或其他正常动物心肌提取的类脂质抗原起沉淀反应（康氏试验）或补体结合反应（华氏试验）,免 疫,以细胞免疫为主，体液免疫只有一定的辅助防御作用当螺旋体从体内清除后可再感染，而且仍可出现一期梅毒症状此病周期性潜伏与再发的原因可能与体内产生的免疫力有关机体免疫力强，螺旋体能变成颗粒形或球形，在体内一些部位潜伏起来，一旦机体免疫力下降，螺旋体又可侵犯体内某些部位而复发。,三、梅 毒,分 类,人是梅毒的唯一传染源由于感染方式不同可分：先天性梅毒：患梅毒的孕妇经胎盘间接传染给胎儿后天性梅毒：出生后感染的，其中95%是由性交直接感染，少数通过输血感染,先天性梅毒,又称胎传梅毒梅毒螺旋体经胎盘进入胎儿血循环，引起胎儿全身感染螺旋体在胎内儿脏（肝、脾、肺及肾上腺）及组织中大量繁殖，造成流产或死胎如胎儿不死则称为梅毒儿，会出皮肤梅毒瘤、骨膜炎、锯齿形牙、神经性耳聋等症状,后天获得性梅毒,表现复杂，依其传染过程可分为三期：一、二期梅毒又统称为早期梅毒，此期传染性强而破坏性小三期梅毒又称为晚期梅毒，该期传染性小，病程长、破坏性大,初期梅毒,梅毒螺旋体侵入皮肤粘膜约三周后，在侵入局部出现无痛性硬结及溃疡，称硬性下疳局部组织镜检可见淋巴细胞及巨噬细胞浸润下疳多发生于外生殖器，其溃疡渗出物含有大量梅毒螺旋体，传染性极强下疳常可自然愈合约23个月无症状的隐伏期后进入第二期,二期梅毒,此期的主要表现为全身皮肤粘膜出现梅毒疹，全身淋巴结肿大，有时亦累及骨、关节、眼及其他器官在梅毒疹及淋巴结中有大量螺旋体。不经治疗症状一般可在3周3个月后自然消退而全愈；部分病例经隐伏312个月后可再发作二期梅毒因治疗不当，经过5年或更久的反复发作，而进入三期,三期梅毒,主要表现为皮肤粘膜的溃疡性损害或内脏器官的肉芽肿样病变（梅毒瘤）严重者在经过1015年后引起心血管及中枢神经系统损害，导致动脉瘤、脊髓痨及全身麻痹等此期的病灶中螺旋体很少，不易检出,梅毒分类总结,Early（infectious）syphilisTime after exposure9-90 days primary6weeks-6months secondary(4-8weeks after primary lesion)2 years (early)Latent Late(non-infectious)syphilis2 years (late)Latent3-20years Tertiary Gummatous Cardiovascular Neurosyphilis Congenital syphilis2 years since birth early congenital syphilis(includes stillbirth)2years Late congenital syphilis,防治原则,梅毒是一种性病，预防的主要措施是加强卫生宣传教育和社会管理目前尚无疫苗预防对病人应早诊、早治，现多采用青霉素3个月1年，以血清中抗体阴转为治愈指标,四、梅毒的实验室诊断,梅毒检测的应用,临床诊断及筛查血源筛查出入境人员等的体检,梅毒螺旋体检查,1暗视野显微镜检查2免疫荧光染色3活体组织检查梅毒螺旋体，如用银染色法（Warthin-starry）法或（Levoaditis法)或荧光抗体染色,螺旋体的鉴别,与雅司、地方性梅毒、品他三种非性病性螺旋体鉴别，还应与齿大螺旋体、齿小螺旋体、软螺旋体、生殖器螺旋体相鉴别 1雅司、地方性梅毒、品他三种非性病螺旋体：形态上不能区别2齿大螺旋体：为疏螺旋体，比梅毒螺旋体长，存在于口腔中，尤其在齿缝内最多； 3齿小螺旋体：比梅毒螺旋体短，旋距也短，运动不规则，两端较中部略宽。主要见于齿垢中； 4软螺旋体：为疏螺旋体，螺旋较少，运动不规律且快，常不断改变其形态。寄生于皮肤溃疡中。 5生殖器螺旋体：比梅毒螺旋体短小，螺旋体大而不规则，生于阴垢内，不经常清洗者检出率较高。 6其他：与螺旋形网状纤维、纤维蛋白细丝、纤毛、串状红细胞等呈螺旋状的物体相鉴别。,基因诊断技术检测梅毒螺旋体,梅毒螺旋体不能进行体外培养。检测临床标本中梅毒螺旋体最敏感、可靠的方法是兔感染试验（RIT），RIT能证实活的梅毒螺旋体存在，是检测梅毒螺旋体常用的标准方法 目前有四套扩增梅毒螺旋体DNA的系统：扩增47KDa膜抗原基因（tpp47基因），扩增39KDa碱性膜蛋白基因（bmp基因），扩增TpF1蛋白基因（tpf-1）或TyF1蛋白基因（tyf-1）和扩增tmpA基因,梅毒血清试验,非梅毒螺旋体抗原血清试验 (非特异性) 梅毒螺旋体抗原血清试验 (特异性),非梅毒螺旋体抗原血清试验,用心磷脂作抗原，测定血清中抗心磷脂抗体，亦称反应素敏感性高而特异性较低，且易发生生物学假阳性早期梅毒患者经充分治疗后，反应素可以消失，早期未经治疗者到晚期，部分病人中反应素也可以减少或消失目前一般作为筛选和定量试验，观察疗效，复发及再感染,非梅毒螺旋体抗原血清试验(早期),1906年Wassermann等首先提出补体结合试验（瓦氏反应)Kahn在1922年发明了一种更为简单的康氏试验其后又在沉淀反应的基础上发展为絮状反应，如Kline试验三种试验其抗原是采用牛心肌粉酒精浸液提取，谓之心肌脂抗原 类似方法据统计有几十种,非梅毒螺旋体抗原血清试验,1性病研究实验室试验（Venereal Disease Research Laboratory test，VDRL）；用心磷脂、卵磷脂及胆固醇为抗原， 缺点：抗原每天配制；血清标本加热灭活；结果在显微镜下观察 2不加热血清反应素玻片试验（Unheated Serum Reagin USR）也是VDRL抗原的改良，敏感性及特异性与VDRL相似，仍需显微镜下观察3快速血浆反应素试验（Rapid Plasma reagin test， RPR）：是VDRL抗原的改良，敏感性及特异性与VDRL相似，加入特制炭粉，可肉眼读出结果4甲苯胺红不加热血清试验（Toluidine red untreated serum test , TRUST）：加特制的甲苯胺红，稳定、颗粒均匀，生产批间差小，结果易观察,非梅毒螺旋体抗原血清试验的特点,敏感性相似，对I、II期梅毒有诊断价值，可作筛查和疗效随访特异性较差，正常人群阳性率达0.1%敏感性:抗心磷脂抗体晚于特异性抗体的出现，晚期可能转阴不适合I期梅毒早期、III期梅毒，对潜伏梅毒和神经梅毒也不敏感阳性时应结合病史、临床症状综合判断，并用梅毒螺旋体试剂盒确证,梅毒螺旋体抗原血清试验,用活的或死的梅毒螺旋体或其成分来作抗原测定抗螺旋体抗体敏感性和特异性均高，一般用作确证试验检测血清中抗梅毒螺旋体IgG抗体，即使患者经过足够治疗，仍能长期存在，甚至终身不消失，血清反应仍持续存在阳性，不能用于观察疗效,梅毒螺旋体抗原血清试验,TPI 梅毒螺旋体制动试验（1949）TPA 梅毒螺旋体凝集试验（1953）TPIA 梅毒螺旋体免疫吸附试验（1953）TPCP 梅毒螺旋体补体结合试验（1953）TPMB 梅毒螺旋体甲基兰试验（1956）WTPCP 梅毒螺旋体（全部）补体结合试验（1957）RFCFR Riter蛋白补体结合试验（1957）TWR 螺旋体瓦色曼反应试验（1957）FTA-200 荧光螺旋体抗体试验200（1960）FTA-ABS 荧光螺旋体抗体吸收试验（1964）TPHA 梅毒螺旋体血凝集试验（1966）TPPA 梅毒螺旋体明胶凝集试验19S-IgM-TPHA 19S-IgM梅毒螺旋体血凝试验IgM-SPHA IgM固相血凝试验TP-IgM-HA 梅毒螺旋体IgM血凝试验IgM-Cap-ELISA 梅毒螺旋体IgM抗体捕捉酶联免疫吸附试验19S-IgM-FTA-ABS 19S-IgM荧光螺旋体抗体吸收试验,梅毒螺旋体制动试验,梅毒螺旋体制动试验（Treponema Pallidum immobilization ，TPI）；用Nichol株螺旋体（活的）加病人血清（含抗体）后，在补体的参与下可抑制螺旋体的活动。如50%梅毒螺旋体停止活动，则为阳性。此试验特异性、敏感性均高，但设备要求高，操作难，仅供研究用,目前常用的梅毒螺旋体抗原血清试验,1荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（fluorescent treponema antibody absorption ，FTA-ABS Test）2梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（T.pallidum particle agglutination ，TPPA）3梅毒螺旋体酶联免疫试验(Treponema Pallidum ELISA),FTA-ABS,间接荧光抗体技术较敏感和较特异的试验，公认为金标准梅毒螺旋体Nichols株作抗原，Reiter株进行吸收FITC标记的抗人抗体步骤多，对照多，结果判定需要经验,TPPA,敏感性和特异性均高，操作简便TPPA取代TPHA明胶颗粒取代红细胞用于抗原的致敏，不需要吸收过程非特异性凝集少对板、枪头要求较高,TP-ELISA,抗原采用超声破碎的螺旋体抗原或重组抗原检测IgM或IgG敏感性和特异性与其他试剂基本一致应作进一步评价,重组梅毒螺旋体抗原,目前已重组的TP抗原有近20多种，如TpN15、TpN17、TpN19、TpN2935（TpD）、TpN44.5（TmP a）、TpN47、TpN35(Tmp c) TP15kD抗原 ：15kD蛋白是一种脂蛋白，首先由Hensel等1985年分离鉴定，它在TP膜蛋白中的含量相对较少，但在免疫印迹试验中与人梅毒血清间显示了超强的反应性 TmP A：TmP a是一个分子量为42kD的TP膜蛋白 ，血清学诊断中的意义 ：一期梅毒76%、二期梅毒100%、早期稳性梅毒98% TP47kD抗原：该蛋白为TP整合性膜蛋白抗原，1986年Norgard等12在大肠杆菌中首先克隆及表达了重组47kD抗原。多中心研究发现13，此蛋白有很强的免疫原性，在TP中含量非常丰富，且为致病菌特有的蛋白,梅毒血清假阳性反应,技术性假阳性反应：如实验室操作错误，标本溶血等，如重复试验，无梅毒患者血清试验成为阴性。生物学假阳性反应：因非螺旋体抗原血清试验是非特异性的，在其它一些疾病，尤以感染性疾病，也可释放心拟脂至血液中，产生反应素，如麻风、麻疹、疟疾、传染性肝炎、病毒性肺炎、传染性单核细胞增多症，系统性红斑狼疮，非典型性肺炎、甚至妊娠都可出现阳性，但这类患者血清反应滴度低，很少超过1：8。而且半年内渐转成阴性。另外可用特异性的梅毒血清反应证实。如用FTAABS试验,梅毒血清假阳性反应的原因,Disease or condition Nontreponemal Treponemal Autoimmune disease Yes Yes Malaria Yes No Recent immunizations Yes No Dermatologic diseases Yes Yes Cardiovascular disease Yes Yes Tuberculosis Yes No Leprosy Yes Yes Intravenous drug abuse Yes No Viral infection Yes No Febrile illness Yes Yes Pregnancy Yes No HIV Yes No Other STD Yes No Age No Yes Multiple blood transfusions Yes No Lyme disease No Yes Endemic treponematoses Yes Yes Transient unknown cause Yes Yes Technical errors Yes Yes,梅毒感染及检测,血清学检测的几个特点,在最初的两周可能是阴性结果FTA、TPPA和ELISA在所有阶段都最敏感VDRL和RPR在三期梅毒期可能为阴性VDRL-CSF仅用于诊断神经性梅毒,梅毒血清试验结果判断,RPR/TRUST TPHA FTA-ABS TPPA 反应结果判断 阴性 阴性 阴性 阴性 排除梅毒感染初期，尚未产生任何 抗体； AIDS病人合并感染梅毒 阴性 阴性 阳性 阳性 既往患梅毒，对FTA-ABS及TPPA非 特异性反应 阳性 阴性 阴性 阴性 生物性假阳性(BFP)，可疑早期梅毒 阳性 阴性 阳性 阳性 早期梅毒，陈旧性梅毒 阴性 阳性 阴性 阴性 梅毒治愈，对TPHA非特异性反应 阴性 阳性 阳性 阳性 先天梅毒，梅毒治愈，其它螺旋体感染 阳性 阳性 阴性 阳性 可疑既往患梅毒，梅毒螺旋体抗体消失 阳性 阳性 阳性 阳性 梅毒(治愈或未治愈),假阳性反应,确无性接触史、性病史、流产史、梅毒病征(如鞍鼻、胡金森氏齿、树胶肿、下疳及梅毒疹等)，及无抗梅治疗史其父母或配偶无梅毒症状、体征及梅毒血清反应阳性史，其本人亦无临床症状在6月内无特殊抗梅治疗，血清反应自动转为阴性者 有发热或其他疾病，经2-4周或更长时间后再验血，血清反应转为阴性者在一次阳性血清反应之前，经数次验血皆为阴性者，亦无性接触及输血史 孕妇梅毒经正规抗梅治疗完毕，其所生初生儿的脐带血呈阳性者，追踪观察婴儿血清，36月后血清反应呈阴性非梅毒螺旋体抗原试验RPR或USR l：2阳性患者，经查TPHA及TPPA皆阴性。,假阴性反应,在梅毒螺旋体感染后12周内可呈阴性反应梅毒螺旋体感染不久即开始治疗晚期梅毒患者的血清中反应素含量低，敏感性低的梅毒血清试验易出现阴性反应在二期梅毒时RPR试验也可出现阴性反应，前带现象(prozone phenomenon),抗梅毒治疗后的血清反应,(1)血清阴转(2)血清滴度降低不阴转，血清抵抗体内仍有潜在的活动性病变存在病人体内的免疫力持久(反应素长久存在)对抗梅药物有耐药性或剂量不足 (3)血清反应复发,各期梅毒的血清学检出率,梅毒血清学检测策略,CDC于2002年度在疾病率和死亡率周报（MMWR） 发表的性传播疾病诊断和治疗指导原则 中，对于梅毒血清学试验指出：The use of only one type of serologic test is insufficient for diagnosisWHO推荐同时采用非梅毒螺旋体和梅毒螺旋体抗原血清试验用于筛查和和诊断,国外的情况,1、美国和欧洲一些国家如法国、比利时采用非梅毒螺旋体抗原血清试验用于筛查2、最近美国开始采用梅毒螺旋体抗原血清试验用于血源筛查3、一些欧洲国家，如德国、荷兰采用梅毒螺旋体抗原血清试验用于筛查4、英国采用两种方法联合使用筛查,各种梅毒螺旋体抗原血清试验所采用的抗原,FTA-ABS 完整螺旋体TPHA 纯化和超声破碎螺旋体TPPA 纯化和超声破碎螺旋体EIA 纯化和超声破碎螺旋体 Immunoblots 纯化和超声破碎螺旋体EIA 重组抗原Latex agglutination 重组抗原,英国PHLS梅毒血清学工作组的建议-