免疫血液检测

红细胞血型检测,新乡医学院 三全 学院,主要内容,输血前免疫血液学检查盐水介质试验技术酶处理试验技术抗球蛋白试验技术聚凝胺介质试验技术微柱凝集试验技术吸收放散试验凝集抑制试验,教学目标,掌握输血前免疫血液学检查内容掌握盐水介质、抗球蛋白试验、聚凝胺介质和微柱凝集试验检测方法试验原理、结果判读及注意事项熟悉吸收放散、凝集抑制试验了解酶处理试验和红细胞血型分子生物学检测技术,第一节输血前免疫血液学检查,一、受血者标本处理二、受血者和供血者ABO和Rh定型三、不规则抗体的筛选和鉴定四、交叉配血试验五、实验结果的规范化报告,一、受血者标本处理,（一）标本的采集（二）标本的接受 核对、询问输血史、妊娠史等、注明最后一次输血日期（三）标本的要求准确无误来自受血者和供血者防止受血者血液标本稀释和（或）溶血受血者标本须输血前3天采集；再次输注时间隔24h，重新采集标本输血后，受血者和供血者标本保存28至少7天,1,4,4,2,4,3,二、受血者和供血者ABO和Rh定型,ABO血型鉴定原理,正向定型：已知的特异性抗体（标准血清）检查红细胞的未知抗原,反向定型：已知的血型的标准红细胞检查血清中的未知抗体,ABO血型鉴定结果判断,ABO正反定型不符分析基本程序,首先重复试验重新采集献血者与受血者血液标本查询受血者既往病史及输血史和用药史等多次洗涤标本红细胞应用抗-AB、抗-A1、抗-H检测红细胞分析O型筛选细胞检测结果,输血治疗的首要步骤组织器官移植新生儿溶血病,ABO正反定型的临床意义,复检正定型血型结果的准确性，纠正漏检、误报亚型能够纠正因疾病原因造成的红细胞抗原减弱造成的血型错误排除获得性抗原（如类B抗原）和冷凝集现象对红细胞定型的干扰不规则抗体,ABO反定型的临床意义,错加试剂或标本,技术和操作,受血者红细胞或血清,ABO正反定型不一致的原因,试剂失效或污染,细胞与血清间比例不适当,溶血现象未能识别,漏加试剂,结果记录或判断错误,血清异常红细胞致敏近期输血疾病导致抗原减弱抗体减弱不规则抗体年龄近期进行大量血浆置换治疗,RhD定型及其常见问题,1.Rh定型RhD定型，试管法最经典，多使用微柱凝胶卡2.RhD阴性确认IgM抗-D阴性,三个厂家IgG抗-D进行确认,抗人球蛋白法进行确认三种IgG抗-D试剂均为阴性，报RhD阴性一种或一种以上IgG抗-D试剂为阳性，报弱D,三、不规则抗体的筛查与鉴定,概念,（一）,考察心得,2,不规则抗体鉴定,（三）,筛查方法,（二）,影响因素,（四）,遇到的问题,五,不规则抗体的筛选和鉴定,患者血清+试剂筛选红细胞 盐水介质 聚凝胺介质（最为常用） 抗人球蛋白介质（最为常用敏感） 酶介质法,要求和内容结果解释及处理方案影响因素,四、交叉配血试验,交叉配血的主次侧,接收申请单和血标本,核对无误（如有错误与医生/护士联系）,进行交叉配血,相合结果输入微机,不相合,打印发血单,血液中心,交叉配血工作流程,五、试验结果的规范化报告,血库收到输血申请单后，进行交叉配血试验申请单：申请日期、需要血液的日期和时间、患者姓名、出生日期、性别、住院号、病房号等信息齐全，并申请人签字发血单：受血者姓名、性别、病案号、ABO及Rh血型、供血者编号及血型、交叉配血实验结果、发出血液品种及血量、发血日期及时间、配血者、发血者和取血者姓名双方核对申请单、血液标签和血液外观等,发血程序（常规和紧急情况）,1.常规情况下发血的一般程序 (1)临床申请 (2)血液新鲜程度的选择(大量用血和新生儿) (3)血型的选择(ABO、Rh、新生儿换血、不规则抗体筛检) (4)交叉配血 (5)发血，做好记录,发血程序（常规和紧急情况）,2.紧急情况下发血的一般程序 (1)快速检血型，选ABO、Rh同型血 (2)标记“未经配血”字样 (3)留供受者血样 (4)发血后做好记录 (5)与临床保持联系,第二节 盐水介质试验技术,本质凝集反应，直接凝集试验检测IgM类抗体基本方法：平板法、试管法、微孔板法,结果判读阳性：凝集或溶血阴性：红细胞呈游离混悬状态,第二节 盐水介质试验技术,瓷板法,试管法,微孔板法,试管法结果判定,红细胞凝集强度判断标准,第三节 酶处理试验技术,试验原理酶试验技术的分类结果判读影响因素,第四节 抗球蛋白试验技术,抗人球蛋白试验：又称Coombs试验，是诊断自身免疫性溶血性贫血的重要依据。主要用于检测IgG、IgA等抗体参与的抗原-抗体反应，也可测定补体组分C3、C4片段参与的免疫反应分类：直接抗球蛋白试验和间接抗球蛋白试验,抗球蛋白试验原理,Coombs利用抗球蛋白抗体作为第二抗体，连接与红细胞表面抗原结合的特异抗体，使红细胞凝集。直接试验：是检查被检红细胞上有无不 完全抗体。间接试验：是检查血清中游离的不完全抗体,直接Coombs试验,抗人免疫球蛋白,自身抗体,间接Coombs试验,抗人免疫球蛋白,同种异型抗体,2不完全抗体可以结合在红细胞表面,但是不能和两个红细胞同时结合（致敏）。,3加入抗人球蛋白,1红细胞彼此之间有一定的间距,4抗人球蛋白可以同时和两个不完全抗体的FC段结合，从而把红细胞连接在一起,2.抗人球蛋白交叉配血法示意图,直接法： 常用于新生儿溶血症、自身免疫性溶血症、特发性自身免疫性贫血和医源性溶血性疾病等的检测。 间接法： 多用于检测母体Rh（D）抗体，以便及早发现和避免新生儿溶血症的发生。亦可对红细胞不相容的输血所产生的血型抗体进行检测。,抗球蛋白试验原理,结果判读,直接抗球蛋白试验阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，被检管凝集，判定为阳性阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，被检管不凝集，需要做阴性确认后判定结果（无凝集的被检管中加入IgG抗-D致敏红细胞后离心，出现凝集判阴性，否则重新试验阳性对照管不凝集和（或）阴性对照管凝集，结果不可信不发报告，分析原因重做,阳性对照管呈现凝集反应，阴性对照管未呈现凝集反应，被检管呈现凝集反应为阳性结果，被检者血清内含有抗体，如果自身对照无凝集，同种抗体；如果被检者结果阴性，被检者血清中未被查出意外抗体。阳性对照管不凝集和（或）阴性对照管出现凝集，实验失败。,结果判读,抗球蛋白试剂不纯,假阳性,假阴性,红细胞洗涤已凝集,红细胞质量,不抗凝标本,漏加试剂,离心过度,红细胞、血清及试剂质量洗涤不充分操作过程不连续离心过度红细胞过多或过少血清浓度过大孵育时间和温度不当前带现象,间接抗球蛋白试验,盐水保存不当,红细胞直抗阳性,抗球蛋白试验的影响因素,抗体亲和力孵育时间和温度：IgG抗体、补体致敏37，3060min离子强度抗原抗体比例洗涤体外补体致敏红细胞自身凝集,第五节 聚凝胺介质试验技术,聚凝胺介质试验技术,是一种快速、简便、红细胞不完全抗体的方法多数IgG抗体能够被检出，但IgG抗-K抗体除外汉族至今未发现K抗原阳性，也未检出抗-K抗体,红细胞抗原抗体反应过程,抗原抗体的靠近： 红细胞抗原位点带负电荷，抗体Fab端带正电（Kell系统抗原带正电荷）抗原抗体的结合： 静电引力、氢键、疏水键及范德华力,影响红细胞抗原抗体反应的因素,离子强度： 反应液中的电解质会增加溶液的介电常数，减弱抗原抗体间的静电作用 降低离子强度可以显著增加抗原抗体结合速率。如:离子强度由0.17M降到0.03M时，抗D和D阳性红细胞的开始结合速率增加1000倍。,红细胞表面电荷及其相互之间的距离,.低离子强度作用原理,当溶液中缺少离子时，抗原抗体之间的静电作用力强当溶液中离子增多时，抗原抗体之间的静电作用力弱,.低离子聚凝胺交叉配血技术,原理：聚凝胺（Polybrene），一种高价阳离子季胺盐多聚物，溶解后能产生很多正电荷，可以中和红细胞表面的负电荷，使红细胞之间距离减少，能引起正常红细胞可逆性的非特异性凝集。如果使抗体致敏的红细胞被聚凝胺凝集，则凝集不可逆。,1 红细胞间有一定间距,2 加入聚凝胺后，可以缩短红细胞之间的距离，使其非特异性凝集,3 加入枸橼酸钠，可以中和聚凝胺,4 红细胞的非特异性凝集消失,聚凝胺交叉配血技术示意图1,聚凝胺,枸橼酸钠,1 红细胞上已有不完全抗体致敏,2 加入聚凝胺后，缩短红细胞之间的距离，让不完全抗体可以同时与两个红细胞结合使其特异性凝集,3 加入枸橼酸钠中和聚凝胺,4 由于不完全抗体的结合，红细胞的特异性凝集不消失,聚凝胺交叉配血技术示意图2,聚凝胺,枸橼酸钠,不完全抗体,注意事项,不能使用含枸橼酸钠和肝素抗凝标本按比例加样，非特异凝集60秒内观察结果出现不配合试验时，抗球蛋白重复，结果不一致时以抗球蛋白试验结果为准一般使用血清对Kell系统检测不理想按照说明书,聚凝胺方法的特点,灵敏：灵敏度高速度快：实验时间5分钟左右准确：准确度高于酶试验不适合于Kell系统抗体的检测，但黄种人群中Kell系统抗体极罕见操作要求较高,第六节微柱凝胶实验技术,凝胶技术的原理,凝胶技术的原理：,A、反应室：下端底孔很小，液体在孵育过程中不会流入下方微柱中。B、试剂或盐水层：红细胞在离心力作用下穿越该层，红细胞与反应室中的血清分离并与该层液体中的试剂反应。C、粘液：亲和柱中有一层粘液，作用与“试剂或盐水层”相同。,原理：凝胶分子筛和亲和效应微柱凝胶柱中填充凝胶（葡聚糖），及相应试剂（抗体或抗原）。凝胶分子间的间隙只允许游离红细胞通过，分子排阻层析原则将发生凝集反应的红细胞阻滞于凝胶之内，而未凝集的游离红细胞则穿过微孔运动到管底，从而判定有无凝集反应。,结果判定,新乡医学院第三临床检验教研室,结果判定,简便准确敏感：在凝胶试验中常能发现其它试验不易发现的问题。结果可保存 凝胶试验的结果可在冰箱中保存数日，并且较容易被拍成照片。操作技术要求较低：凝胶试验的操作主要是简单的加样和判读，孵育、离心过程都有专门的设备。其中能被人为改变的因素较少。无需洗涤的抗人球蛋白试验,优点：,第七节 吸收放散试验,吸收试验原理,待检红细胞,已知效价的抗A或抗B血清,吸收液,已知抗原的红细胞,滴定,比较吸收前后血清中抗体效价,红细胞上有无相应抗原及其强度,间接判定待检红细胞血型及其亚型种类,热放散试验原理,待检红细胞,分型血清,物理条件的改变（加热）,抗体,待检红细胞,试 剂红细胞,确定抗体的种类和强度,判定待检红细胞上抗原的型别,放散,凝集或致敏,吸收放散试验应用,证实存在于红细胞上的弱抗原分离、鉴定混合抗体除去血清中不需要的抗体浓缩低效价抗体核实抗体特异性鉴定新生儿溶血病和免疫性输血反应的抗体研究鉴别免疫性溶血性贫血的抗体,第八节 凝集抑制试验,凝集抑制试验,可溶性血型物质：血型抗原除了存在于人体的红细胞膜上以外，某些也以游离形式存在于血浆、尿液等液体中。ABH、P物质等与对应的血型抗体结合，可中和该抗体，或使该抗体凝集对应红细胞的能力受到抑制，成为凝集抑制试验,凝集抑制试验原理