海洋胶原肽对伤口愈合的研究

海洋胶原肽对大鼠剖宫产术后伤口愈合的影响,提纲,一、研究背景二、研究目的三、材料和方法四、结果五、讨论六、结论七、致谢,一、研究背景,1.剖宫产的现状2.剖宫产的并发症3.伤口愈合不良的危害4.伤口愈合的过程5.治疗现状6.胶原蛋白7.海洋胶原肽(MCP),剖宫产的现状,剖宫产的现状,剖宫产的现状,中国 20世纪90年代初城市剖宫产率达20%左右；自90年代中期开始快速攀升，90年代末国内大城市医院的剖宫产率即已达到30%40%；目前虽无全国统计数据，但大多数城市医院报道的剖宫产率约在40%60%，高者甚至达60%80%以上。,剖宫产的并发症,近期：麻醉意外、术后出血、产后感染、肺栓塞远期：盆腔粘连、子宫内膜异位症、影响子宫的解剖结构、对身体及各器官的影响、再孕时剖宫产切口瘢痕处妊娠、子宫破裂,伤口愈合不良的危害,若伤口愈合不良，将给产妇带来术中术后出血、术后切口感染、切口裂开等危害，并增加慢性盆腔痛、盆腔粘连、子宫内膜异位症、剖宫产瘢痕妊娠(CSP)、继发不育、流产的发生率。,伤口愈合过程,治疗现状,基因工程的应用生物工程材料的使用纳米技术的应用中西医结合技术的应用创面覆盖物的应用营养辅助治疗激光刺激高压氧治疗其他治疗方法: 心理治疗、 真空辅助创口愈合技术,胶原蛋白,胶原蛋白体外应用有改善表皮细胞微循环和促进皮肤组织新陈代谢的作用，从而加速组织再生与修复。胶原蛋白含有丰富的细胞代谢所需的氨基酸，可改善皮肤细胞的生存环境，促进皮肤组织的新陈代谢。,海洋胶原肽(MCP),海洋胶原肽：氨基酸组成均衡、全面，有很好的溶解性、低黏度、高浓度、水溶性、热稳定性，在体内吸收快、利用率高。国内外已有部分研究论证了海洋生物活性肽对实验动物具有抗损伤和抗氧化等功效。我们课题组以往的研究表明：海洋低聚肽具有延缓皮肤衰老、保护肾功能、调节血糖、改善老年记忆、调节免疫、防辐射及预防骨质疏松的活性；海洋胶原肽具有较强的抗氧化活性，可以清除体内的自由基，减少炎症反应，增强小鼠免疫功能，进而增强抗感染能力。,二、研究目的,观察MCP对伤口愈合的影响 探讨MCP促进愈合的作用机制,三、材料和方法,受试物：海洋胶原肽 淡黄色粉末，由北京中食海氏生物技术有限公司提供。以深海鱼的鱼皮为主要原料，经过清洗匀浆-复合偶联酶解-酶失活-脱脂-多级膜分离-渗透精制-浓缩-脱色-造粒干燥等工艺制成。 根据我们课题组以往实验及预实验的结果，设立0.13g/kg.bw、0.38g/kg.bw、1.15g/kg.bw三个MCP剂量组，对照组给予等体积溶剂灌胃。,材料,实验动物孕16天的健康SD大鼠350400gSPF级动物房饲养饲养环境温度2123湿度50%60%RH,材料,主要仪器,UV7512GD型紫外可见分光光度计超速离心机XHC型漩涡混匀器电子天平光学显微镜80低温冰箱Pclab-UE生物医学信号采集处理系统,主要试剂,羟脯氨酸测试盒FGF抗体TGF-1抗体CD31兔二步法免疫组化检测试剂盒浓缩型DAB试剂盒其他试剂均为国产或进口分析纯,实验方法,动物分组及处理96只孕16天的SD大鼠，随机分为4组，每组24只，均给予基础饲料。经过适应性喂养3天后，在孕19天进行剖宫产手术，手术当天在基础饲料的基础上增加灌胃。低剂量MCP组，术后每天给予0.13 g/kg.bw剂量的海洋胶原肽灌胃；中剂量MCP组，术后每天给予0.38g/kg.bw剂量的海洋胶原肽灌胃；高剂量MCP组，术后每天给予1.15g/kg.bw剂量的海洋胶原肽灌胃；空白对照组，术后每天灌胃相同体积的生理盐水。,实验方法,手术方案 1%苯巴比妥钠腹腔注射麻醉，在下腹部沿腹中线切开3cm 纵切口，打开腹腔，在两侧子宫背对肠系膜侧的中部各做2.0cm的纵向切口，挤出大鼠幼崽和胎盘。用5-0可吸收性外科肠线连续缝合，深腹、筋膜、腹膜用4-0丝线缝合，皮肤用4-0丝线缝合。术后涂2%碘酊，注射青霉素0.1ml，放回鼠笼里，注意保暖，术后禁食1天，正常饮水。,实验方法,样品的收集在术后7天、14天、21天每组分别取8只大鼠，颈椎脱臼法处死动物，取伤口皮肤、子宫组织，称重后，1/2用于测量力学指标，1/4放入液氮中迅速冷冻，-80冰箱中保存。剩下的1/4组织用10%中性甲醛固定后，备用。,观察指标,一般指标：大鼠的一般情况、伤口愈合的时间、肉眼观察情况。每周记录大鼠体重及摄食量，每3天测量大鼠腰围，脏器收集时观察腹部的粘连情况，对粘连情况进行分级判断，同时记录子宫重量。力学指标：皮肤张力和子宫破裂压力。羟脯氨酸含量：样本碱水解法。病理组织学检查： HE染色、胶原染色。细胞因子的表达：免疫组织化学染色。,统计分析,数据以均数标准差(xs)表示数据采用SPSS13.0处理计量资料采用T检验、单因素方差分析组间的粘连情况采用秩和检验检验水平=0.05,四、实验结果,1 一般指标1.1 大鼠的一般情况实验期间各组大鼠无死亡，未出现拒食现象，动物生长及活动正常，行为、毛色、精神状况、饮食、饮水及粪便均未见明显异常。,1.2伤口愈合时间与肉眼观察情况,伤口的平均愈合时间为67d。灌胃海洋胶原肽实验组大鼠的伤口，比对照组大鼠伤口能提前1-2天愈合。,肉眼观察伤口愈合良好，未发现红肿、积液、皮肤坏死、切口破裂等不良反应。MCP组伤口愈合后，与对照组相比，伤口表面光滑无结痂。因此认为胶原肽对伤口愈合起着显著的愈合作用。,1.3 对大鼠体重及摄食量的影响,体重数据显示各实验组大鼠的体重显现出先减少再增加的趋势，与对照组比较，差异无统计学意义(p0.05)。,1.4 对大鼠腰围的影响,各实验组大鼠的腰围均呈现出一个先下降后回升至稳定水平的趋势，各MCP剂量组数据与空白对照组相比较，差异无统计学意义(p0.05)。,1.5 对大鼠腹部粘连情况的影响,对大鼠腹部的粘连情况进行分级，大鼠多为中度粘连，采用单向有序分类变量秩和检验，检验统计量Hc=0.359， p0.05，可以认为，各实验组大鼠腹部粘连情况的差异没有统计学意义。,1.6 对大鼠子宫重量的影响,2 力学指标,对数据进行单因素方差分析，结果表明中剂量组在21天时皮肤张力高于空白对照组，差异有统计学意义(p0.05)；高剂量组7天和21天的皮肤张力均高于空白对照组，差异有统计学意义(p0.05)。,2 力学指标,子宫压力的数据表明，低剂量组和中剂量组的子宫压力与空白对照组相比，差异没有统计学意义(p0.05)。而高剂量组在在7天、21天时子宫压力均大于对照组， 差异有统计学意义(p0.05)。,3 对羟脯氨酸含量的影响,4 组织病理学检查,镜下可见较多的中性粒细胞、浆细胞和淋巴细胞等炎性细胞浸润，细胞间质疏松，新生的毛细血管芽和成纤维细胞增生不明显。,镜下可见较多的中性粒细胞、浆细胞和淋巴细胞等炎性细胞浸润，有新生的毛细血管芽和成纤维细胞增生。大量成纤维细胞呈梭状，细胞质丰富，胞核较大，呈椭圆形，核仁明显。,HE染色：术后14天,镜下可见仍有较多炎性细胞浸润，细长梭状的纤维细胞排列紊乱，细胞间质水肿明显，胶原纤维增生不明显。,镜下可见大量细长梭状纤维细胞和大量束状排列胶原纤维增生。,HE染色：术后第21天,伤口表皮以增生为主，瘢痕组织较多，炎性细胞浸润较多。,伤口表皮完整，瘢痕组织明显少于对照组，炎性细胞明显减少。,胶原染色,MCP组有大量胶原纤维束及波浪形的弹性纤维， MCP组胶原纤维数量明显多于对照组，且排列整齐。,5 免疫组化检测细胞因子的表达,5.1 伤口组织中TGF-1的表达,术后第14、21天的伤口组织中TGF-1表达显著高于对照组(p0.05)。,5.2 伤口组织中bFGF的表达,术后第7、14天高剂量组伤口组织中bFGF的表达均高于空白对照组，差异有显著性(p0.05)。,5.3 伤口组织中CD31的表达,CD31阳性反应出现在血管内皮细胞，用来标记微血管，7d时达到峰值，之后便呈减少趋势，14、21d没有发现差异性。,五、讨论,1 关于动物模型和指标的选择 动物模型：对孕鼠进行剖宫产术，建立剖宫产术动物模型，模拟了临床剖宫产情况，形成组织形态与生物学与人剖宫产近似的伤口组织，再现了剖宫产术后伤口愈合的过程。剖宫产动物模型在国内外应用较少，本实验创新性的将剖宫产术大鼠模型应用于MCP对伤口愈合影响的研究，这在国内尚属首例。 力学指标：在本研究中，我们基于剖宫产术动物模型的基础上，由力学角度分析MCP对伤口愈合的影响，新增加了皮肤张力和子宫破裂压力指标的测定，二者都是定量的指标，能够更加准确的反应皮肤和子宫伤口抗拉力和伸展强度，明确判断伤口愈合的好坏，正确的反应MCP对伤口愈合的影响，使得本实验的结果更加科学、可信度较强。,2 MCP对伤口愈合的作用,2.1 对一般情况的影响实验期间大鼠无死亡，状态良好，一般情况及病理均未出现明显异常，说明MCP在本试验剂量范围内是安全的，对动物不产生毒副作用。各剂量组和空白对照组的体重、腰围、摄食量、子宫重量没有统计学差异，并且体重、腰围、及子宫重量的变化均呈现出由高到低的变化趋势，与各个时间点的生理状况相吻合，符合孕鼠产后身体及子宫复旧的正常生理变化，说明MCP不影响孕鼠正常的身体恢复。,2 MCP对伤口愈合的作用,2.2 缩短伤口愈合时间 本研究结果表明MCP组大鼠伤口愈合的时间明显小于对照组，这说明MCP可以缩短伤口组织愈合的时间，减少产妇术后伤口治疗的过程，对于减少住院时间，降低医疗费用有一定的意义。2.3 增加伤口组织的力学指标 本研究结果表明MCP能增加术后伤口皮肤张力和子宫破裂压力，这对于剖宫产妇来说极为重要。术后伤口皮肤张力和子宫破裂压力的增加，意味着产妇术后伤口愈合良好，皮肤的伸展性恢复得较好，抗拉力的强度增大，可以承受住剖宫产术后再次妊娠，从而减少CSP的发生，降低剖宫产术后再次妊娠的风险。,2 MCP对伤口愈合的作用,2.4 对伤口组织形态学的影响MCP能增加早期伤口组织中新生毛细血管和成纤维细胞的生成，缩短伤口愈合过程中的炎症反应期，促进伤口组织成纤维细胞及早形成，促进血管再生，从而改善伤口组织中微循环，增加局部供氧，促进微血管和胶原生成，加快伤口愈合。,3 MCP促进伤口愈合的机制,1 增加氨基酸原料的供给。 创伤愈合的一个重要过程，是成纤维细胞利用氨基酸原料，合成胶原蛋白，如果氨基酸原料供给不足，必将造成愈合延迟。羟脯氨酸是构成结缔组织胶原的重要成分，对胶原蛋白分子在生理温度下形成三股螺旋的绳状结构及其稳定性具有重要意义，其含量多少与结缔组织的抗拉力强度有很大关系。本研究中高剂量组皮肤伤口中羟脯氨酸的含量在3个时间点上均高于对照组，说明MCP能够能够提供充足的氨基酸原料，促进伤口中羟脯氨酸含量的增加，从而利于胶原蛋白的合成，增加胶原蛋白分子的稳定性，增强皮肤的抗拉力强度，促进伤口愈合。我们课题组以往的研究表明MCP可通过促进伤口皮肤胶原蛋白的合成，从而促进伤口愈合，结论与本研究相一致。,3 MCP促进伤口愈合的机制,2 促进伤口愈合的修复细胞的形成，特别是增加参与肉芽组织形成的成纤维细胞。 本实验伤口7天的病理学检查和免疫组化结果均表明成纤维细胞的数量和胶原纤维的含量明显增加，MCP可通过增加成纤维细胞的数量和胶原纤维的含量，从而促进伤口的愈合。,3 MCP促进伤口愈合的机制,3 为皮肤提供营养物质。 伤口愈合的过程需要以营养为基础，而MCP可以增加新生血管的形成，改善血循环，增加伤口组织局部营养，为伤口愈合提供充足的营养。4 缩短愈合过程中的炎性反应期。 MCP可在早期增加伤口组织中炎性细胞的浸润，缩短愈合过程中的炎性反应期，从而缩短愈合时间，促进伤口愈合。,3 MCP促进伤口愈合的机制,5 促进生长因子表达。 本实验结果表明MCP可以增强TGF-1、bFGF、CD31的表达，提示在伤口的愈合过程中：（1）MCP可能通过增强TGF-1的表达，促进产生胶原纤维和ECM，诱导肉芽组织生长和表皮形成，来促进伤口的愈合。（2）MCP可增强伤口组织中bFGF的表达，并维持在较高的水平，从而增加新生血管的形成，促进血管平滑肌细胞、内皮细胞增生，参与炎症反应和组织修复，缩短伤口愈合时间，促进伤口的愈合。（3）MCP组微血管计数（CD31）在7d时显著高于对照组，而且病理学观察也发现术后7dMCP组毛细血管数量最多，说明MCP能增加毛细血管的数量，为创面的快速愈合提供了良好的血供，从而促进伤口的愈合。,六、结 论,MCP对