《酶的分离和纯化》PPT课件.ppt

第二章酶的分离和纯化IsolationandPurificationofenzyme 方法概括原料处理 包括组织破碎 缓冲液抽粗分级 一般采用硫铵沉淀 乙醇沉淀或其他方法细分级 一般采用离子交换层析 凝胶层析 亲和层析和电泳 第一节原料选择及预处理 动物原料 动物组织或脏器 活体取出 充分脱血 10 50 保存植物原料 植物原料磨碎加入缓冲液抽提植物原料特点 1 纤维含量高2 酚酶活力高3 缓冲液pH易被细胞内物质改变微生物原料 菌体培养做酶活 时间曲线确定最大酶活时间 细胞破碎 微生物细胞破碎一般采用1 化学法 碱 去垢剂 有机溶剂 酶解 冰冻复融2 物理法 热处理 渗透压 减压 声波振荡3 机械法 加磨料 研磨 挤压4 缓冲液抽提抽提缓冲液的加入要少量多次 植物酶抽提时可加5mM的Vc 第二节酶的粗提 沉淀核酸沉淀 a MnCl2 硫酸鱼精蛋白 链霉素可使核酸沉淀 离心除掉 b 加入核酸酶将其降解杂蛋白沉淀 根据目的酶的特性方法各异选择性沉淀 盐析 最常用的方法 沉淀过程中随时监测蛋白浓度和酶活力讨论 a 盐的加入速度合适 b 蛋白质开始沉淀处的硫铵浓度与蛋白浓度有关 c 硫铵浓度表示法 饱和度25 4 1M d 硫铵饱和溶液pH 7 若目的酶易酸变性必须用缓冲液 e 硫铵溶液密度较高 1 24 故需较大离心力此步可除去75 以上的杂蛋白 且可使蛋白浓缩 透析与浓缩 1 透析袋处理 透析袋0 5MEDTA煮半小时蒸馏水煮半小时反复八次带橡皮手套用镊子拿取2 透析除盐 200倍于被透析物 4小时换一次透析液 监测电导值SephadexG25除盐 柱长50cm 上样小于床体积的20 3 浓缩 a 火棉胶b 聚乙二醇 PEG c 超滤 3 5kg cm2 d 冻干 透析技术原理图 超滤技术原理图 第三节酶的精制 一 层析技术 chromatography 1 分配层析 物质在两相中的分配系数不同a 纸层b 薄层 比纸层灵敏100倍但剥板困难 c 柱层2 吸附层析 absorptionchromatography 吸附剂对通过它的物质吸附力不同 吸附力包括离子引力 疏水作用 范德华力和氢键a 薄层b 柱层填料一般为硅胶 氧化铝 磷酸钙 活性白土和羟基磷灰石 常用羟基磷灰石 带正电 稳定范围pH5 5 10 吸附量1mg g湿剂 纸层 薄层 3 离子交换层析 ionexchangechromatography 交换剂上带电荷 可根据样品的电荷予以分离a 阳离子交换层析b 阴离子交换层析c 离子交换剂的类型 离子交换树脂 离子交换纤维素 离子交换凝胶d 实验室常用的离子交换剂 阴离子交换剂DEAE Cellulose DEAE Sephadex 阳离子交换剂CM Cellulose CM Sephadexe 离子交换剂的预处理 去杂质 溶胀 除小颗粒 改型阳离子交换剂 碱 水 酸 水 平衡阴离子交换剂 酸 水 碱 水 平衡 f 柱层析 床体积等于2 5倍束缚样品需要量 径 高 1 15 上样量不超过柱体积的10 注意上样方法 洗脱方法有两种 不连续梯度洗脱和连续梯度洗脱 分布收集器收集每管2 3mlg 交换剂后处理 饱和NaCl 水 酸或碱 水 平衡 连续梯度洗脱 梯度混合器 离子交换层析 阳离子交换剂阴离子交换剂 Anionexchangechromatography 4 凝胶层析 分子筛层析 gelfiltrationchromatography 根据分子量大小予以分离 a 凝胶预处理 凝胶 浸入洗脱液 轻轻搅拌 加热90 100 水浴加热 b 层析柱准备 2 5 100柱 稠胶灌柱 2 3个床体积的缓冲液平衡 流速16 18ml hc 层析 兰葡聚糖 分子量2 106 验柱并求外水体积 V0 上样量1 5 恒压洗脱 流速16 18ml hd 凝胶后处理 0 5NNaOH 0 5NNaCl处理后4 保存长时间不用可采用乙醇脱水保存或低温干燥保存 凝胶过滤层析原理图 Gelfiltrationchromatography 5 亲和层析 affinitychromatography 特异性结合 a 关键 配体 配体与支持物的连接方法 吸附 洗脱条件b 支持物的选择 非特异性吸附作用低 液体流动性好 较宽的pH 离子强度 丰富的化学基团 有效的多孔性常用琼脂糖 聚丙烯酰胺凝胶和受控多孔玻璃球c 配体的选择 有亲和力但不易过大d 配体与支持物的连接 载体结合法 物理吸附法 交联法 包埋法 先活化支持物上的功能基团再将配体连上去 e 吸附剂的衍生物 支持物 空间臂f 层析条件的选择 蛋白质 配体 蛋白质 配体复合物起初配体浓度恒定 随蛋白浓度增加平衡右移 逐渐保留特性 故亲和力较低也能成功的亲和 g 洗脱 更高亲和力的物质置换 剧烈改变环境条件 亲和层析原理 Affinitychromatography 二 超离心技术利用物质的沉降系数 质量 浮力因子等方面的差别用强离心力进行分离 F w2r F 相对离心力RCF RCF以g的倍数表示 RCF w2r 980w 转数 分 30RCF 1 119 10 5r 转数 分 2离心机 a 桌式 3000转 分红血球 酵母细胞等粗沉淀物b 高速离心机 20000 25000转 分一般实验使用但病毒 小细胞器或单个分子不能沉降c 超速离心机 75000转 分分子生物学必备 能分级只有在电镜下才能看得见的亚细胞器 二 电泳 electrophoresis 技术 1 原理 M dL EtM 迁移率L 颗粒泳动距离t 通电时间E 电势差迁移率与下列因素有关 a 样品带电状态 分子形状与大小b 电场强度c 缓冲液pH的和离子强度d 支持介质的阻力 吸附作用2 电泳类型 a 纸电泳b 醋酸纤维薄膜电泳c 琼脂糖电泳d 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE和SDS PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳 Acr Bis TEMED 0 4 过硫酸胺 0 01 0 03 等电聚焦 isoelectricfocusing 两性电解质在电场作用下建立一个pH梯度分离蛋白质电泳检测 a 考马斯亮兰 氨基黑 染色法b 荧光染色法c 特异酶检测d 其他染色法 盘状电泳 A 和平板电泳 B 第四节提纯过程中的定量 蛋白质浓度 1 双缩脲法 Cu 与肽键及酪氨酸残基络合显色 测定浓度0 5 10mg ml2 Lowry法 双缩脲法的改进 Cu 与蛋白质在碱性溶液中络合 此络合物还原Folin试剂 测定浓度20 400 g ml3 紫外吸收法 Tyr Trp Phe在280nm有最大光吸收 此方法因上述三种氨基酸含量不同测定结果有误差测定浓度0 1 0 5mg ml4 Bradford法 该法是根据蛋白质与考马斯亮蓝 coomassiebrilliantblue 结合产生的蓝色物质在595nm有最大光吸收来测定蛋白质浓度的 该方法简单 快速 可靠 灵敏度高 可测定1 10mg的蛋白质 酶活力 检测目的酶的活力目的蛋白 非酶 检测较困难 纯化倍数 回收率 100 酶的提纯过程记录格式 第五节酶蛋白分子量的测定 渗透压法超速离心法凝胶层析法SDS 聚丙烯酰胺电泳法 渗透压法 M为蛋白质的摩尔质量 分子量 R为气体常数 0 082升 大气压 摩尔 度 T为绝对温度 为了测定蛋白质的分子量 分别取几个不同的蛋白质浓度c 测出对应的渗透压 然后以 c对c作图 并作延长线外推至c 0 得到的y轴截距即为lim c的值 代入上式可求得分子量M 渗透压法适合测定分子量范围在10 000 100 000的蛋白质 其优点是实验装置简单 测定也较为准确 缺点是要求蛋白样品纯度高 否则测出的将是溶液中各种蛋白的平均分子量 超速离心法 M 分子量S 沉降系数R 气体常数T 绝对温度D 扩散系数 溶质分子微分比容 介质密度 SDS 聚丙烯酰胺电泳法 M 被测蛋白分子量a b 常数 用已知分子量蛋白作标准曲线求得de 酶蛋白的泳动距离do 小分子染料的泳动距离亚基分子量 SDS PAGE的分子量标准曲线 凝胶层析法 M 被测蛋白分子量a b 常数 用已知分子量蛋白作标准曲线求得Ve 酶蛋白洗脱体积Vo 空体积 可用蓝葡聚糖求得 凝胶过滤分子量标准曲线 思考题 下表是一种酶的各个纯化步骤的总蛋白和总活性单位数 从表中给出的信息计算每一纯化步骤得到的酶溶液的比活 哪一纯化步骤最有效 即相对纯度增加