血细胞分析仪检测原理与影响因素

血细胞分析仪检测原理与影响因素,前言,传统的血常规分析法完全采用手工法。20世纪50年代，库尔特（W. H. Coulter）先生根据电阻抗原理，又称库尔特原理，生产出第一台血细胞计数仪，开创了血细胞分析仪的新纪元，使人工计数实现自动化。随着科学技术的发展，血细胞分析仪也日新月异，目前己普及至县或卫生院。,前言,美国COULTER公司的STKS、MAXM系列血细胞分析仪 -电阻抗、高频电导及激光散射联合检测法 Bayer公司的Advia120型和新近推出的Advia 2120型血细胞分析仪 -激光和细胞化学法 日本东亚公司的NE1500、SYSMEX公司的SE9000血细胞分析仪-电阻抗和射频电导联合检测法 ABBOTT公司的CD3000，CD3500血细胞分析仪-多角度激光偏振光散射检测法,常用的血细胞分析仪：,血细胞分析仪的主要功能,血细胞计数功能 测量WBC、 RBC 、 PLT 、MCV、RET等白细胞分类功能 测量NE%、LYM%、MO%、EO%、BA%等血红蛋白检测功能 测量HGB,血细胞计数的检测原理,电阻抗法流式细胞术与光散射法检测原理,电阻抗法检测原理,血细胞具有相对非导电的性质,悬浮在电解质溶液中的血细胞颗粒通过计数小孔 时可引起电阻及电压的变化，出现脉冲信号,脉冲的数量=细胞的数量 脉冲的大小=细胞的大小,该原理又称库尔特原理（Coulter principle） 测量 RBC,WBC,PLT,MCV,MPV,电阻抗法检测原理,电阻抗法影响因素,白细胞:,由于多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、淋巴系统增殖性疾病、转 移癌、自身免疫性疾病、感染及某些原因不明疾病血中含有冷 球蛋白，或骨髓瘤、癌症、白血病、妊娠、血栓疾病、糖尿病 病人血中存在有冷纤维蛋白等，均可导致血液中某些物质凝集， 致使白细胞计数增高。此时将稀释标本放在37度水浴10min后 立即计数可消除此影响.,有核红细胞出现使白细胞计数假性增高；,低色素性贫血或红细胞内含大量sHb或HbCO，或某些新生儿及某 些肝病病人红细胞膜脂类异常,从而产生抗溶血剂作用，红细胞 溶解不完全；,多发性骨髓瘤的M蛋白增多时，PH低的情况下，M蛋白可与溶血剂 发生反应而使结果偏高；,各种病理引起的血栓前状态使血小板易于聚集，上机时影响结果,电阻抗法影响因素,红细胞:,血小板:红细胞碎片和脂血中与血小板大小相似的乳糜 微粒等作为血小板计数，导致血小板计数偏高。,RBC:在某种病理情况下，如白血病，白细胞数明显增加而又 伴严重贫血时，即可使所得各项参数产生明显误差。 MCH:不能探测单个红细胞的结构（MCH=总HGB/RBC） MCV及MCHC :红细胞通过小孔时经受一定的形态学变化，红细 胞形态与细胞质黏度有关，细胞质黏度受细胞HGB含量影响， 因此HGB浓度可影响细胞形态，进而影响MCV及MCHC的准确性 （MCHC=HGB/HCT),流式细胞术与光散射法检测原理,白细胞计数 红细胞和血小板计数 网织红细胞计数 有核红细胞计数,流式细胞术与光散射法检测原理,白细胞计数,利用流式细胞术,单个细胞随着流体动力聚集的鞘流液通过激光照射的检测区时,使光束发生折射、衍射和散射,散射光由光检测器接受后产生脉冲,脉冲的大小与被照细胞的大小成正比脉冲的数量代表细胞的数量,流式细胞术与光散射法检测原理,红细胞和血小板计数,在红细胞/血小板通道中，RBC/PLT试剂与血液混合反应，将自然状态下的红细胞/血小板变成球形并经戊二醛固定后使单个细胞逐个经过检测器,低角度前向激光（23）测量单个细胞体积与总数 高角度激光（5 15）测量单个细胞的折射指数(RI),根据单个细胞体积和其相应细胞的折射指数，可将红细胞和血小板区分开来，并准确得出相应的参数。细胞的折射指数(RI): 反映细胞内容物的浓度。,流式细胞术与光散射法检测原理,红细胞和血小板计数,流式细胞术与光散射法检测原理,网织红细胞计数,网织红细胞分析采用某些染料（如核酸染料Oxazine 750）染色的原理，并将细胞球形化，用激光二维法对网织红细胞进行分析测定。,前向角光散射强度=细胞大小荧光强度=胞内RNA浓度,根据荧光强度，可将网织红细胞分成低吸收荧光强度网织红细胞（LFR)、中吸收荧光强度网织红细胞(MFR)和高吸收荧光强度网织红细胞(HFR)三部分。幼稚网织红细胞显示最强的荧光,流式细胞术与光散射法检测原理,仪器还可提供网织红细胞成熟指数（reticulocyte mature index，RMI）。RMI=,网织红细胞计数,RMI增高与骨髓移植、慢性溶血、近期出血或疗效 反应有关； RMI降低通常提示骨髓衰竭或无效造血。,HFR+MFR LFR,流式细胞术与光散射法影响因素,病人样品中的有核红细胞 (尤其是新生儿样品)能够使白细 胞计数假性升高。,样品的冷凝集现象可能引起红细胞计数假性降低,出现在镰形红细胞贫血中的一些不可逆的镰形细胞在本系 统中可能不完全呈圆球形，从而导致RDW 升高，因而也低 估了MCV值。镰形细胞可能引起其它红细胞参数的错误。,流式细胞术与光散射法影响因素,接受全肠道外营养的(TPN)病人样品，其中包括高脂剂，可能出现血小板计数假性升高。这些样品能够包含脂滴，并且这些脂滴会出现在血小板计数区域。,血小板大量聚集时，有时造成血小板假性降低，且无 报警提示,白细胞分类的功能,白细胞二分群、三分群计数原理白细胞五分类计数原理,容量、电导、光散射法 激光与细胞化学法 电阻抗与射频法 多角度偏振光散射检测原理,白细胞二分群、三分群计数原理,根据电阻抗的原理，不同体积的白细胞通过小孔时产生的脉冲大小有明显的差异，根据脉冲的大小，血细胞仪对白细胞进行分群。,经溶血素处理后，红细胞迅速溶解，白细胞胞质 经细胞膜渗出，胞膜紧裹在细胞核或颗粒周围脱 水的细胞体积与其自然体积无关，取决于脱水后 细胞内有形物质的多少。,仪器将体积为35450fL的血细胞分为256个通道， 每个通道为1.64fL，根据细胞大小初步确认细胞群， 并显示出白细胞体积直方图,白细胞二分群、三分群计数原理,根据电阻抗的原理，不同体积的白细胞通过小孔时产生的脉冲大小有明显的差异，根据脉冲的大小，血细胞仪对白细胞进行分群。,淋巴细胞,中性粒细胞,单核细胞，嗜酸粒细胞嗜碱粒细胞，白血病细胞核左移的各阶段幼稚细胞,白细胞二分群、三分群计数影响因素,电阻法只是根据细胞体积的大小，将白细胞分成几个群体。在一个群体中，可能发某种细胞为主（如小细胞区主要是淋巴细胞），但由于细胞体积间的交叉，可能还有其它细胞的存在。任何一类白细胞的增多，均可使直方图产生相似变化，直方图只是提示检查者粗略判断细胞比例变化或有无明显的异常细胞出现，进而在显微镜下检查中注意这些变化，实际分类以手工分类为准。,外周血出现有核红细胞或巨大血小板，采血时由于技术问 题造成血小板聚集或某些病理因素使红细胞膜对溶血剂有 抵抗作用，使红细胞溶血不完全，致待测标本中有大量红 细胞膜碎片等情况，均可使白细胞直方图在50fl以下区域 出现一个或大或小的小峰。使小细胞区计数假性升高,容量、电导、光散射法检测原理,在测试的标本内加溶血剂，使红细胞溶解,加入抗溶血稳定剂，中和溶血剂的作用，使白细胞表面、胞质及细胞大小等特征仍保持与体内时相同的状态,使用鞘流技术，使溶血后液体内白细胞分别单个通过激光检测区接受检测,VSC技术是全血未经任何处理，血细胞保持与体内形态完全相同状态下得出的检测结果,容量、电导、光散射法检测原理,电阻抗原理：检测细胞体积,电导技术：根据细胞壁能产生高频电流的性能，用高频电磁探针测量细胞内部结构，通过细胞核和细胞质的比例、细胞内颗粒的大小和密度，辨别体积相同、但性质不同的两个细胞群体,如LY和BA,光散射技术：来自激光源的单色光直接扫描计数敏感区的细胞，根据细胞产生的不同角度散射光（1070），提供细胞形态、胞核结构等光散射信息，并鉴别细胞颗粒的构型核质量（粗颗粒的光散射比细颗粒的更强），可区别出粒细胞（NE、BA、EO)的类型,容量、电导、光散射法检测原理,根据VSC原理，可显示 三种细胞散点图DF1：体积值和散射光值DF2：体积值和电导值DF3：体积值和电导值，但除去了EO和NE部分，只显示嗜碱粒细胞群,容量、电导、光散射法影响因素,幼稚细胞等白血病细胞使分类异常未成熟粒细胞与核左移细胞常引起MO%假性升高,激光与细胞化学法检测原理,血样和过氧化物酶试剂混合后，溶解RBC,过氧化物酶通道,白细胞与过氧化物酶试剂反应,染色深浅 与细胞过氧化物酶活性成正比,过氧化酶活性：EONEMO LYM与BA无活性,激光与细胞化学法检测原理,根据胞浆中过氧化物酶染色深浅和激光法测量的细胞大小不同，将白细胞分成嗜酸性粒细胞、单核细胞、中性粒细胞、大而未染色细胞、淋巴和嗜碱细胞淋巴和嗜碱性粒细胞由于大小相似而不能分开。,激光与细胞化学法检测原理,嗜碱性粒细胞/分叶核通道,嗜碱性粒细胞/分叶核通道反应示意图,血样和嗜碱反应试剂混合后，由 于试剂中苯二甲酸和表面活性剂 的作用，红细胞和血小板溶解， 除嗜碱性粒细胞外，其他白细胞 膜破裂而失去胞浆,根据细胞核的形状和复杂性，将白细胞分成单个核和多形核细胞，并可对中性粒细胞分叶程度进行分析。,嗜碱性粒细胞保持完整，体积较大，很容易从小细胞群中识别开来。,激光与细胞化学法检测原理,当嗜碱性粒细胞与其它被溶解了细胞膜的细胞核流入激光二维检测系统，根据前向角和散射角检测的结果，产生了二维细胞图，进而将白细胞进一步进行分类。结合根据过氧化物酶通道的结果，将白细胞进行完整的分类。,激光与细胞化学法影响因素,病理情况下，嗜酸粒细胞分类受标本白细胞形态异常影响假性升高幼稚细胞等白血病细胞使分类异常,电阻抗与射频法检测原理,嗜酸性粒细胞检测系统：血液进入仪器后，经分血器使血液与嗜酸性粒细胞特异计数的溶血剂混合，由于其特殊的PH，使除嗜酸性粒细胞以外的所有细胞溶解或萎缩，含有完整的嗜酸性粒细胞的液体通过小孔时，使计数电路产生脉冲而被计数。,嗜碱性粒细胞检测系统：计数原理与嗜酸性粒细胞相 同，由于碱性溶血剂只能保留与血液中嗜碱性的粒细 胞，因此根据脉冲的多少即可求得嗜碱性粒细胞数。,上述二种方法除需要使用专一的溶血剂外，还需特定 的作用温度和时间。,电阻抗与射频法检测原理,淋巴、单核、粒细胞（中性、嗜碱性、嗜酸性）的检测系统：,这个系统采用电阻抗与射频联合检测的方式,本法使用的溶血剂的作用较轻，细胞形态改变不大。,在小孔的内外电极上存有直流（DC）和高频（RF）两个 放射器，因此细胞进入小孔时产生两个不同的脉冲信号,脉冲的高低分别代表细胞的大小和核内颗粒的密度，,以DC信号为横坐标，RF为纵坐标，就可根据2个信号把 同一个细胞定位于二维的细胞散射图上。,由于LYM、MO及粒细胞的细胞大小、细胞质含量，胞质内 颗粒的大小与密度、细胞核的形态与密度不同，DC及RF 的脉冲信号有较大的差异，定位在各自散射的区域，通 过扫描技术得出各类细胞比例,电阻抗与射频法检测原理,幼稚细胞检测系统：此胞膜上脂质较成熟细胞少的现象，在细胞悬液加入硫化氨基酸后，由于细胞上脂质占位不同，故结合在幼稚细胞的硫化氨基酸较成熟的细胞多，且对溶血剂有抵抗作用。当加入溶血剂后，成熟细胞被溶解，如果悬液中存在幼稚细胞，其形态不受破坏，因此可通过电阻抗的方法检测出来。,多角度偏振光散射检测原理,一定体积的全血标本用鞘液按适当比例稀释。,其白细胞内部结构近似于自然状态，因嗜碱性粒细胞颗粒 具有吸湿的特性，所以嗜碱性粒细胞的结构有轻微改变。,红细胞内部的渗透透压高于鞘液的渗透压而发生改变， 红细胞内的血红蛋白从细胞内游离出来，而鞘液内的水份 进入红细胞中，细胞膜的结构仍然完整，但此时的红细胞 折光指数与鞘液的相同，故红细胞不干扰白细胞检测。,在鞘液的作用下，样本被集中为一个直径为30m的小股 液流，该液流将稀释细胞单个排列，因是单个通过激光束， 故在各个方向都有其散射光。,多角度偏振光散射检测原理,可以从四个角度测定散射光的密度：,0：前角光散射（13）粗略地测定细胞大小；,10：狭角光散射（711）测细胞结构及其复杂性 的相对特征；,90：90消偏振光散射（70110），基于颗粒可以 将垂直角度的偏振激光消偏振的特性，将嗜酸细胞从中性 粒细胞和其它细胞中分离出来。,90：垂直光散射（70110）主要对细胞内部颗粒和 细胞成分进行测量。,可以从这四个角度同时对单个白细胞进行测量，将白细胞 分为EO、NE、BA、LYM和MONO5种。,血红蛋白检测原理,稀释血液+溶血剂,溶血剂中某些成分,+,血红蛋白衍生物,形成,比色（：530550nm),RBC溶解释放HGB,吸光度变化与稀释液HGB 含量成正比 ICSH推荐使用氰化高铁法 HICN最大吸收峰在540nm 各型号血细胞分析仪必须 以HICN值为标准进行校正 非氰化溶血剂: SLS,十二烷基月桂酰硫酸钠,HGB测试系统,血红蛋白检测影响因素,高白细胞计数的样品(60 x 109细胞/L)、或有血小板凝块、或新生儿样品可能干扰血红蛋白的检测。过度脂血、乳糜微粒，高胆红素或血红蛋白过高的样品可能干扰样品的检测结果、使采所得的结果升高，而MCHC也升高。,小结血细胞仪的比较,五分类的血细胞仪从技术上较前上了一个更高的平台，特别是血小板计数更加可靠，五分类比三分群又增加一些新的参数，五分类必将取代三分群的仪器，这是必然趋势。 三分类其实是将细胞按照体积大小进行了简单的分群处理，实际上是不科学的，因此国内专家和学者建议将此分类统一称呼为分群（group），即三分群型血细胞分析仪。实际细胞分类需做细胞染色镜检。,小结血细胞仪的比较,目前BAYERADVIA120是唯一可对红细胞的体积和色素含量进行分析的仪器。 BAYERADVIA120同时直接检测单个红细胞的HGB，可以同氰化高铁法通道检测的血红蛋白浓度相比较，减少因高白细胞数或脂血等因素造成的影响在白细胞分类方面，激光与细胞化学法与容量、电导、光散射法相比，有较强的筛选能力，但在EO%分类方面， BAYERADVIA120逊色于Coulter,小结-血细胞分析仪的发展近况和展望,血常规检验多参数化：近年来许多仪器都在增加新的参数以满足临床在诊断和鉴别诊断方面的需求，但很多的新参数目前仍不能应用于临床，仅限定在实验室中，或供研究使用。多功能合成扩展：如增加网织红细胞，幼稚细胞，有核红细胞，脑脊液细胞等的分析功能检测速度的提高：BAYERADVIA2120等仪器可以达到每小时120个标本