食品质量与安全12医学免疫学2

主讲人：刘晓波 基础学院病原生物学与免疫学系 email: Tel食品免疫学,第十章 抗原和抗体的 制备与应用,一、抗原概念（主要针对适应性免疫） 进入机体能诱导特异性免疫应答、产生免疫效应物质（免疫应答产物），并能与相应免疫效应物质特异性结合的物质。二、抗原类型（一）根据抗原基本特性 完全抗原（complement antigen）：大多数蛋白、 细菌、病毒等。 不完全抗原或半抗原：仅具有抗原性。大多数多糖、 类脂和某些药物分子（二）其它分类 天然抗原和人工抗原： 颗粒性抗原和可溶性抗原： 蛋白质抗原、多糖抗原和多肽抗原：,1、颗粒天然抗原的制备（1）细菌抗原的制备 过程: 复苏细菌检验细菌扩大培养细菌 灭活菌体收获抗原（2）细菌鞭毛抗原制备 培养鞭毛丰富的细菌加入甲醛于室温或37 处理24h （3）病毒抗原制备 培养病毒（动物、鸡胚或细胞培养）鉴定培养物分离纯化病毒颗粒（密度梯度离心、凝胶过滤或亲和层析等）灭活病毒（加热、冻融、pH、有机溶剂或氧化剂等）,（4）红细胞抗原 过程: 新鲜血液与抗凝剂混合离心洗涤数次以无菌生理盐水将血细胞配成2%-5%血细胞悬液即可。（5）组织和细胞粗抗原制备 处理好的细胞或组织剪成小块粉碎（高速组织捣碎机或研磨法）组织匀浆离心，取上清液高速离心，取上清液即可。2、可溶性抗原的制备 过程: 细胞破碎（冻融法、超声法、酶法等） 分离纯化离心法、选择性沉淀（核酸去除、盐析法、有机溶剂沉淀法、凝胶过滤、离子交换层析、电泳等）、亲和层析法等鉴定（含量、纯度及活性测定）。,3、人工抗原的制备 人工抗原=半抗原+载体（1）半抗原：多糖、多肽、脂肪酸、药物分子等。 在农产品和食品中的半抗原：农药、兽药、 添加剂、真菌毒素、生物碱等。（2）常用载体： 蛋白类：BSA（牛血清白蛋白）、HSA（牛血清白蛋 白）、 RSA（兔血清白蛋白）、OVA（鸡 卵白蛋白）、KLH（匙孔戚血蓝素，血蓝 蛋白）等。 多肽类聚合物：常用多聚赖氨酸。 其它大分子聚合物：如淀粉、硫酸葡聚糖等。 颗粒载体：聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素等。,（3）半抗原与载体的连接物理方法：载体与半抗原之间电荷、疏水作用等。 如聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素等颗粒 性载体与半抗原。化学方法：最常用。两者的某些功能基团共价连接。 两者本身携带的活性基团（游离氨基、羧基或 羟基等)直接连接。 双功能试剂（碳二亚胺、戊二醛、SPDP等） 两端活性基团架桥连接。,（4）半抗原与载体的连接物的分析鉴定： 两者的摩尔比。 方法： 吸收光谱分析法（紫外、红外、质谱、磁共振） 电泳法（SDS-PAGE） 三、免疫用抗原的处理 佐剂： 1、含义：与抗原一起或先于抗原注入机体后,可增强 机体对抗原免疫应答能力或改变免疫应答 类型的物质。2、作用机制： 改变抗原物理性状，可使抗原缓慢释放 使抗原易于被巨噬细胞等抗原递呈细胞处理,2、种类：福氏佐剂、氢氧化铝、Poly I:C等 福氏佐剂（Freud adjuvant）：油包水型，需乳化 福氏不完全佐剂：油剂（石蜡油）+乳化剂 （羊毛脂） 福氏完全佐剂：福氏不完全佐剂+卡介苗 乳化方法：研磨法、注射器混合法等二、抗体的制备 多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体（一）多克隆抗体（polyclonal Antibody,PcAb) 为第一代抗体,1、含义：多个细胞克隆在一种抗原的多种表位刺激 下所产生的抗体混合物。 来源于动物免疫血清、恢复期病人血清或免疫接种人群。2、优点：制备简单，识别抗原谱广，可有效地阻断 抗原对机体的危害。3、缺点：由血清而来，为血液制品，安全性差； 特异性不高；易发生交叉反应；不均一、 批次变异大。作为靶向性载体不理想。,多价抗原,单克隆（致敏的B细胞）,单克隆抗体,4、制备： 实验动物的选择：家兔、山羊、豚鼠等。 免疫剂量： 免疫间隔时间：10-20d 免疫途径：肌肉、皮内、皮下、静脉、腹腔、 脾脏或淋巴结5、免疫血液收集 颈动脉放血法： 心脏采血法： 静脉多次采血法：,6、抗血清的分离和保存 多采用室温、37 或4 自然凝固。 保存：分装成小包装 4 ，需过滤除菌或加入0.1%0.2%NaN3或硫柳汞等防腐剂。16个月。低温（-40-20 ）；5年冷冻干燥：510年7、抗体的纯化（1）去除杂抗体 免疫吸附法（不含特异性抗原的抗原）（2）IgG分离,盐析：硫酸铵法 三步法（40%、35%、33%饱和度） 一步法（35%-40%饱和度）：常用阴离子交换剂法：常用DEAE纤维素或QAE纤维素 在pH7.5，Ig带正电荷而血清中其他蛋白带负电荷亲和层析法 抗原-Sepharose层析柱：硫氰酸钾洗脱 SPA-Sepharose层析柱：结合pH8-9，洗脱pH2-4 SPG-Sepharose层析柱：结合pH5-7，洗脱pH9-10 A/G-Sepharose层析柱:更广泛IgG结合 嗜硫色谱（TAC）：将含硫配基偶联于SepharoseCL- 4B等固相载体；配基上砜-硫醚基可与IgG结合,8、抗血清及纯化抗体的鉴定（1）效价测定 效价（titer）：即滴度。特异性抗体的相对含量； 一般将抗体经一系列稀释后与定量抗原反应， 以能检出抗原的抗体最大稀释度为效价。 ELISA、琼脂双向扩散、血凝试验等（2）亲和力和亲合力 亲和力（affinity）：抗体与一个抗原表位结合力 亲和常数K表示，一般1081010 L/mol 亲合力（avidity）：抗体与抗原分子总结合强度（3）抗体特异性和交叉反应 琼脂扩散法 竞争抑制曲线,（二）单克隆抗体（Monoclonal Antibody,McAb) 为第二代抗体1、含义：单个细胞克隆在一种表位刺激下所生的 抗体。 来源于体外细胞融合技术建立杂交瘤细胞株。 Khler和Milstein于1975年发明，通过杂交瘤技术获得，为生物学领域的革命性的技术。2、优点：特异性高，均一性强，易于大量生产等。3、不足：一般为鼠源性抗体，对人具有较强免疫 原性。,Georeges Koehler Nobel Prize in 1984,Cesar MilsteinNobel Prize in 1984,4、制备过程（1）动物免疫： 一般用BALB/C小鼠（对应骨髓瘤细胞株SP2/0、 NS-1、Ag8.653等），8-12w，免疫3-4只 大鼠Lou/C（对应骨髓瘤细胞株Y3-Ag1.2.3） 免疫程序一般同于抗血清制备（2）准备工作： 骨髓瘤细胞准备：HGPRT（次黄嘌呤磷酸核糖转移 酶）缺陷细胞。 饲养细胞（feeder cells）准备：一般为小鼠腹 腔巨噬细胞。 选择培养基HAT、融合剂等准备,i、HAT培养基选择的原理： HAT：HHypoxanthine次黄嘌呤，能被HRPT （次黄嘌呤磷酸核糖转移酶）转化成次黄嘌 呤核苷磷酸(IMP)，用于DNA合成。 AAminopterin氨基喋呤，二氢叶酸类似 物，抑制起始合成途径。 TThymidine 胸腺嘧啶核苷。能被TK （胸苷激酶）转化成脱氧胸腺嘧啶核苷 磷酸(dTMP)，再进一步合成核酸。 核苷酸的合成： 起始合成途径（denovo pathway）：由氨基酸及 其他小分子化合物合成，叶酸作为重要的辅 酶参与这一过程，氨基喋呤是一种叶酸的拮 抗物，可以阻断该途径。,中间合成途径（salvage pathway）：HGPRT酶将 次黄嘌呤（H）转化成次黄嘌呤核苷磷酸 (IMP)；TK酶的将胸腺嘧啶核苷（T）转化成 脱氧胸腺嘧啶核苷磷酸(dTMP)，再进一步 合成核酸。由于氨基蝶呤（A）可阻碍起始 合成途径，细胞便只有中间合成途径，所以 必须供给H和T。至于缺失中间合成途径的细 胞（骨髓瘤细胞），可失去增殖能力而死亡ii、融合剂：一般为PEG（聚乙二醇），分子量1000 2000； 仙台病毒、高频电场融合（效率高、但细胞易死亡）,（3）分离B细胞：脾脏分离 加强免疫后3d短颈处死小鼠无菌操作取脾脏挤压、研磨制备脾脏匀浆洗涤、计数。（4）细胞融合： 细胞比例： 骨髓瘤细胞：脾细胞=1:2-1:10，常为1:5（5）培养：将融合物用HAT培养基混合，加入在96孔 板中。待细胞克隆长出来： 骨髓瘤细胞+脾细胞融合：存活并生长 骨髓瘤细胞+骨髓瘤细胞融合：不能存活，死亡 单独骨髓瘤细胞：不能存活，死亡 单独B细胞：有寿命，最终死亡 脾细胞+脾细胞融合：有寿命，最终死亡,（6）筛选及细胞克隆化 镜检：融合后3d开始，逐孔 换HT培养液：半量 筛选：待孔中克隆细胞超过视野1/2时，取上清 检测，确定阳性孔。一般为间接ELISA （包被抗原）（7）克隆阳性孔细胞： 有限稀释法： FACS法（8）再次筛选鉴定，并扩大培养该分泌孔细胞并冻存 同上筛选法；选取强阳性孔扩大培养细胞。 冻存方法：液氮保存（永久），-60-80低 温保存（临时）,（9）多次克隆及建杂交瘤细胞株 选取强阳性孔细胞进行亚克隆、亚亚克隆等。扩大多次克隆均为阳性且阳性率为100%的孔细胞。（10）杂交瘤细胞鉴定：计数杂交瘤细胞染色体数目 秋水仙素阻断法：小鼠骨髓瘤染色体40条、 B细胞46条（11）抗体鉴定： 同前多克隆抗体（12）抗体扩大制备小鼠腹腔制备：产腹水，抗体含量高（510mg/ml） 过程：BALB/C小鼠腹腔注射石蜡油或降植烷 7d后注射杂交瘤细胞（106-107） 710d后形成腹水抽取腹水（35ml/只）,大瓶细胞培养：纯度高，但含量低。一般可用无血 清培养基。中空纤维反应器：产量高、易于纯化。,（三）基因工程抗体（genetic engineering antibody)或重组抗体 概念：采用DNA重组技术和蛋白质工程技术， 在DNA水平上对Ig分子进行切割、拼接 或修饰，组成新型抗体分子。 优点：可降低或消除抗体免疫原性（人源化） 使抗体小型化；去除或减少无关结构； 可赋予抗体分子新的生物学活性。,类别：对鼠源性抗体的改造 人源化： 小型化： 人鼠嵌合抗体（chimeric antibody)： 改型抗体（reshaping Ab)：又称CDR移植抗 体(CDR-grafted Ab) 单链抗体（ingle chain FV,ScFV）： 单一肽链按-linker-L或 L-linker-H顺序组成。,嵌合抗体、CDR移植抗体,三、抗体的应用（一）抗体作为检测、诊断试剂1、作为亲和层析和免疫磁珠配体：可纯化抗原或 细胞等。2、作为研究工作中的分子探针3、作为分析检验试剂（1）病原微生物检测：（2）毒素、农药残留物、兽药残留物等药物检测：（3）微量成分测定（二）抗体作为药物制剂1、阻断、封闭、中和作用：2、特异性结合靶目标，介导其清除或破坏,（三）作为靶向或导向载体1、免疫毒素（immuntoxin）： Ab+毒素分子（蓖麻毒素等）2、免疫细胞因子：Ab+细胞因子（IFN等）3、免疫连接物：Ab+化疗药物（阿霉素等）抗体与药物连接物：Mylotarg（抗CD33抗体 +calicheamicin）抗体与酶连接物：ADEPT(antibody directed enzyme prodrug therapy,抗体导向的 酶-前药疗法）：Ab+胞嘧啶脱氨酶可使 5-Fu转化成5-Fu。,4、免疫微粒或免疫纳米粒： 将载药物的微粒或纳米粒与抗体结合即成； 具有载药量大、控缓释性、靶向性等。5、免疫脂质体： 将载药物的脂质体与抗体结合即成6、抗体靶向或导向的核酸转运载体： 聚乙烯亚胺等,第十一章 抗原抗体反应与非标记免疫分析,血清学试验（serology）一、含义：抗原与抗体的体外特异性结合反应。二、特点或一般规律：高度特异性：抗原与抗体结合的专一性、互补性。 抗原表位与抗体V区的CDR互补性地结合。 抗体的结合能力： 亲合力（avidity）： 亲和力（affinity）：抗体分子的单一抗原结 合部位与一个相应表位的结合能力 抗原结合价（antigenic valence）：抗原分子 表面与抗体结合的表位总数。,purple : HV CDR ( in both the ribbon and ball and stick views) green : antigen HV sequences contact the antigen.,antibody,antigen,antigen-antibody complex:,epitope,结合迅速：数秒至数分钟可完成可逆性: Ab+AgAb-Ag K=-= 抗原-抗体结合为非共价键结合，在一定条件下可被解离，因此易受环境因素影响（温度、PH值、离子强度等）。 氢键（hydrogen bond） 离子键（ionic bond） 疏水键（hydrophobic interaction） 范德瓦耳斯力（van der Waals interaction）,K2,K2,K1,K1,Ab-Ag,AbAg,可见性：如抗原-抗体的数量比例合适，抗原和抗体 分子相互交叉形成网格状复合体，此时出现 肉眼可见的反应物（网格：沉淀物或凝集物）,三、影响抗原抗体可见反应的因素 抗原-抗体可见反应阶段： 特异性结合阶段：反应迅速，可在数秒-数分 钟内完成。 可见反应阶段：小的抗原-抗体复合物形成大 的肉眼可见复合物的过程（）电解质：多为生理盐水（）pH值：（）温度：（）其它：适当的震荡或搅拌,四、血清学试验的优势（1）高度特异性：表位上基团性质、位置，甚至空间 构型影响抗体与抗原结合。说明抗体分子 精细的分辨能力！（2）通过人工方法，较容易地获得更高特异性抗体。（3）对已知的几乎所有抗原包括半抗原，可通过人工 方法，获得其特异性抗体。,五、抗原和抗体反应的类型 凝集反应 沉淀反应 非标记免疫技术 补体参与的反应 中和反应 免疫标记技术,（一）凝集反应（agglutination reaction）1、原理：颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体 混合后，在一定条件下可形成肉眼可见的凝 集团块。2、种类：（1）直接凝集反应：将颗粒性抗原与相应抗体直接结合，出现细菌凝集或红细胞凝集现象 如菌种鉴定、ABO血型鉴定、肥达氏反应等。玻片凝集反应：定性试验，通常用已知抗体诊断未 知抗原。此法特异、简便、快速，常用于细菌 分型鉴定和人类ABO血型鉴定。,颗粒性抗原,抗体,可见的凝集块,直接凝集反应,试管凝集反应：半定量试验。常用已知的标准抗 原为诊断试剂，检测血清中特异性抗体及其 含量。 肥大反应（Widal test）：检测患者伤寒杆菌感 染情况。伤寒和副伤寒沙门菌菌液为抗原， 检测病人血清中相应抗体。（2)间接凝集反应：将可溶性抗原（或抗体）吸附在 颗粒性载体（红细胞、乳胶颗粒等）表面，载 体颗粒被动地发生凝集反应。特点：更灵敏、 微量、快速、操作简便等。 常用载体颗粒：红细胞、活性碳粒、聚苯乙烯 乳胶颗粒等。,据载体性质： 间接血凝试验：载体颗粒为红细胞 碳粒凝集试验：载体颗粒为碳粒 乳胶凝集试验：载体颗粒为乳胶,据致敏载体是抗原或者抗体及凝集方式：正向间接凝集试验：抗原致敏载体，检测抗体。反向间接凝集试验：特异性抗体致敏载体，检测 抗原。间接凝集抑制试验：抗原致敏载体及相应抗体作为 检测试剂，检测标本中是否存在与致敏载体结 合的抗原相同的抗原。协同凝集试验： 富含SPA的金黄色葡萄球菌+Ig抗体,（二）沉淀反应（precipitation reaction）1、原理：可溶性抗原与相应抗体混合后，在一定条件 下可形成肉眼可见的沉淀物。2、种类：（1）无支持物的沉淀反应：环状沉淀反应、絮状沉淀 反应，免疫比浊。-液相沉淀试验（2）有支持物的沉淀反应：以半固体琼脂凝胶作为介 质进行琼脂扩散或免疫扩散：可溶性抗原和 抗体在凝胶中扩散后在比例合适处相遇， 形成可见的白色沉淀线。-凝胶扩散试验,环状沉淀试验：如法医学上血迹等。鉴定敏感性较 低，现少用。絮状沉淀试验：常用于毒素与抗毒素的滴定。免疫比浊法： 原理：抗原抗体复合物（IC）使反应液出现浊度； 如反应液中抗体过量，形成的IC与抗原量呈 正相关。快速简便。用于血清IgG、IgA、 IgM、补体C3、C4含量测定。 种类： 直接比浊测定：透射比浊、散射比浊。 乳胶浊度测定： 免疫速率散射浊度测定法：,单向琼脂扩散（single radial immunodiffusion）： 将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制成琼脂板， 在适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。定量试 验，简便、易于观察结果；常用于测定血清Ig和补 体的含量。,1,7,2,3,6,1,2,3,7,4,5,6,双向琼脂扩散（double immunodiffusion）：将抗原 和抗体分别加入琼脂凝胶小孔中，二者自由向四周 扩散，在相遇处可形成沉淀线。常用于抗原抗体纯 度及其相关关系分析。 用于抗原性质分析： 用于抗体效价测定：,1,7,2,3,6,1,2,3,7,4,5,6,免疫电泳：抗原在琼脂凝胶中电泳后分成不同区带， 再进行双向免疫扩散的方法。在各区带 相应的位置形成沉淀弧。,1,7,2,3,6,1,2,3,7,4,5,6,火箭电泳：单向免疫扩散同电泳结合的方法。 抗原在含有定量抗体的琼脂中泳动，两者比 例适宜时，在较短时间内生成锥形的沉淀峰。 在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含 量成正比。特点：需时较短，故可用于快速 沉淀标本中抗原的含量。,（三）补体结合试验（complement fixation reaction） 抗体与红细胞表面的抗原结合，加入补体，能 导致红细胞溶解，根据溶血现象判定结果。 较凝集试验、沉淀试验敏感性高。 试验系统：已知抗原（或抗体）+待检的未知抗体 （或抗原）+补体 指示系统：溶血素（抗体）+绵羊红细胞（SRBC） 如试验系统中抗原+抗体发生反应，则消耗补体，指 示系统中无补体，SRBC不溶解，则反应阳性（+） 如试验系统中抗原+抗体不发生反应，则补体存在， 指示系统中有补体，SRBC溶解，则反应阴性（-）,Ag,Ab,补体,抗体阳性,待检系统,指示系统,溶血反应,红细胞,溶血素,不溶血 +,抗体阴性,Ag,Ab,补体,红细胞,溶血素,溶血_,（四）中和试验 细菌外毒素或病毒与相应抗体结合后，失去了其生物效应。该抗体被称为中和抗体。此试验可在动物、鸡胚或细胞培养中进行。 毒素中和试验： 病毒中和试验： 抗链球菌溶血素“O试验：,（五）免疫标记技术 即标记物标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。 1、原理: 用标记物(荧光素、酶、放射性同位素、电 子致密物等)标记抗体或抗原，进行抗原- 抗体反应。 2、特点:灵敏度高、快速，可定性、定量和定位. 3、常用种类: 免疫荧光法 酶免疫法 放射免疫测定法 免疫胶体金技术 免疫印迹法 发光免疫分析 一抗：与抗原结合 二抗：与一抗结合，即抗抗体,第十二章 标记免疫技术及分析应用,免疫标记技术（immunolabelling techinique） 即标记物标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。 1、原理: 用标记物(荧光素、酶、放射性同位素、电 子致密物等)标记抗体或抗原，进行抗原- 抗体反应。 2、特点:灵敏度高、快速，可定性、定量和定位. 3、常用种类: 酶免疫法 放射免疫测定法 免疫胶体金技术 免疫荧光法 免疫印迹法 发光免疫分析 一抗：与抗原结合 二抗：与一抗结合，即抗抗体,一、酶免疫标记技术 酶标记的抗体或抗原作为主要试剂，结合酶催化反应的高效性进行的抗原-抗体反应，通过酶作用的底物显色来判定结果。（一）特性： 酶催化底物反应的放大作用，提高 敏感性。 HRP（辣根过氧化物酶），AP（碱性磷酸酶） 底物（供氢体，无色）+ H2O2 氧化型供氢体（颜 色）+H2O 供氢体：邻苯二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）、 DAB等。,酶,（二）酶免疫技术的分类 酶免疫组化：检测组织切片或细胞涂片中的抗原 原 酶免疫技术 均相酶免疫测定 酶免疫测定 固相酶免疫测定 异相酶免疫测定 （ELISA） 液相酶免疫测定,（液体标本）,均相与异相区别：异相需分离游离与结合的 酶标记物。,1、免疫组化技术： 检测组织切片或细胞涂片中的抗原。可识别标本中抗原的位置和性质，通过图像分析定量。 常规酶免疫组化：光镜 酶免疫电镜：电镜,2、均相酶免疫分析:不需分离游离与结合的酶标记物（1）EMIT：enzyme-mutiplied immunoassay technique，酶放大免疫测定技术。抗原竞争性结合。 半抗原与酶结合形成酶标半抗原，保留各自的活力；酶标半抗原与抗体结合后，因空间位阻影响酶活力，导致酶活力下降或消失。 EMIT试剂盒：抗体、酶标半抗原、底物。 检测样品：标本中的半抗原。,（2）CEDIA：cloned enzyme donorimmunoassay， 克隆酶供体免疫分析。抗原竞争性结合。利用重组DNA技术制备-半乳糖苷酶的片段： 酶受体（enzyme acceptor，EA）：大片段，无酶活性 酶供体（enzyme donor，ED）：小片段，无酶活性 ED-EA：具酶活性。 抗原（Ag）与ED结合形成ED-Ag，可与EA结合成全酶，具有酶活力；ED-Ag与抗体结合后，因空间位阻影响全酶形成，导致酶活力下降或消失。 CEDIA试剂盒：ED-Ag、EA、抗体、底物。 检测样品：标本中的抗原。,3、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 将可溶性抗原（抗体）吸附到固相载体表面，并保持其活性；与标本中抗体（抗原）反应后，仅需经过固相洗涤，就可实现抗原抗体复合物与其它物质的分离，大大简化操作步骤。为应用最广泛、发展最迅速的技术。 步骤： 包被：抗原（抗体）吸附到固相载体表面。 固相载体：一般聚苯乙烯制品。 封闭：避免非特异性吸附。如BSA 抗原抗体结合: 多次洗涤: 显色测定：加底物。 常用方法：,（1）间接法（indirect ELISA）抗原包被，需用标记的二抗,（2）双抗体夹心法（sandwich ELISA） 捕获抗体：包被用抗体 检测抗体：适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇,（3）竞争法（competing ELISA） 酶标Ag与样品中的非标记Ag具有相同的与固相Ab结合的能力。抗原主要为小分子抗原的定量测定,原,原,测定管,对照管,（4）捕获法（IgM-antibody capture ELISA，Mac ELISA） 反向间接ELISA，用于测定IgM（传染病早期或新近感染）。 固相载体包被抗IgM二抗（作为捕捉抗体吸附待检血清中IgM），加入待检血清，再加入特异性抗原（与被捕捉的IgM结合），再加入酶标抗体。 固相-抗IgM二抗-IgM-特异性抗原-酶标抗体,（5）BAS-ELISA BAS=biotin-avidin system，生物素-亲和素系统。 是一种反应放大系统，BAS-ELISA比普通ELISA敏感4-16倍。i、生物素（biotin，B）：分子量244.3，其咪唑酮环能与亲和素结合；四氢噻唑吩环的侧链羧基可与抗体等蛋白结合，也可加以化学修饰制成活化生物素等。ii、亲和素（avidin，A）卵白亲和素：抗生物素蛋白，存在于卵清中；分子 量68kd，由四个相同亚基构成，能高亲和力地 结合4个生物素分子，且高度特异和稳定。链霉亲和素（streptavidin，SA）：链霉菌分泌的蛋白；分子量65kd，由4条相同肽链构成，每一条结合1个生物素；非特异性小于卵白亲和素。,iii、BAS-ELISA 增强ELISA特异性和敏感性。 常见方法：ABC-ELISA：ABC=avidin biotin peroxidase complex，亲和素-生物素-过氧化物酶复合物。 如ABC-ELISA夹心法： 固相抗体+待测抗原+生物素化抗体+（亲和素-生物素化 过氧化物酶复合物，即ABC）+底物显色。BA-ELISA：固相载体+待测抗原+（生物素化抗体+亲和素-酶，即BA）+ 底物显色。BAB-ELISA：固相抗体+待测抗原+（生物素化抗体+亲和素+生物素化过酶，即BAB）+底物显色。,抗原包被的反应板,（6）酶联免疫斑点试验(ELISPOT,Enzyme-Linked ImmunoSPOT)：检测细胞因子或特异性抗体分泌细胞。,检测抗体特异性B细胞,T细胞产生CK的检测,4、固相膜免疫测定 原理：固相膜免疫测定与ELISA相类似,其特点 是以微孔膜作为固相；常用固相膜为硝 酸纤维素（NC）膜。 类型： 斑点酶免疫吸附试验（dot-ELISA） 免疫印迹法 (Western blot),（1）斑点ELISA (dot-ELISA),（2）免疫印迹法（immuno blotting） 亦被称为Western blot.是将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫等技术测定。该法能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量。常用于检测多种病毒 如HIV 的抗体或抗原。分三个阶段进行 :SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电转移 酶免疫定位,二、放射免疫测定法(Radioimmunoassay, RIA) 是用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫学检测技术。它将放射性核素显示的高灵敏性和抗原抗体反应的特异性结合，使检测的敏感性达pg水平。常用于标记的放射性核素有I125和I131。常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。 缺点：专门防护检测设备昂贵。,放射免疫测定法(RIA)示意图,RIA法原理及标准曲线,75,50,30,10,0,1,10,100,1000,未标记抗原浓度（ng/ml),结合/未结合的放射活性（%）,三、免疫荧光法(immunofluorescence assay，IF) 荧光素(FITC、PE等)标记抗体形成荧光抗体进行 的抗原-抗体反应，置荧光显微镜下观察或进行荧光免疫测定。 FITC：异硫氰酸荧光素。激发后发出黄绿色荧光。 RB200：四乙基罗丹明。激发后发出橘红色荧光。 PE：藻红蛋白。激发后发出橙、红色荧光。 TRITC：四甲基异硫氰酸罗丹明。激发后发出红 色荧光。（一）荧光抗体染色：免疫荧光细胞（组织）化学 技术。一般采用荧光显微镜或Confocal （激光共聚焦显微镜）,1、直接法,优点：操作简便、特异性高、非特异染色低。缺点：灵敏度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特 异荧光抗体。,2、间接法,优点：灵敏度高，在不同抗原的检测中只需应用 一种荧光抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。,（二）荧光免疫测定 一般应用荧光分光光度计测定。 1、均相法：如双标记法。2、非均相法：可采用与ELISA相似的步骤进行。3、流式细胞术（Flow Cytometry, FCM)： FCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集，为当代生命科学研究领域中广泛使用的一项新技术。 FACS：fluorescence activated cell sorter。 荧光激活细胞分选器。,流式细胞仪工作原理,4、荧光偏振免疫测定（fluorescence polarization immunoassay，FPIA） 均相竞争法，荧光素标记的半抗原与标本中的待测半抗原与一定量抗体竞争结合；偏振荧光强度与标本中待测半抗原浓度成反比；可用于小分子半抗原特别是药物的测定。5、时间分辨荧光免疫测定（time resolved fluorescence immunoassay，TR-FIA） 以稀土螯合物如铕（Eu）作为荧光标记物；Eu具长寿命荧光，比背景荧光长百万倍，待短寿命的本底荧光完全衰退后再进行测定，所得信号完全为长寿命螯合物的荧光；其测定方法相似于ELISA，将Eu标记抗体等；所测仪器为时间分辨荧光计。,四、发光免疫分析技术 将发光分析与免疫反应结合的一种超微量分析技术。将鲁米诺等发光剂标记抗体（抗原），通过发光检测抗原（抗体）。 该发光为化学发光（化学反应过程释放的能量激发了发光剂发光）。 敏感性高、不需外来光源、信噪比高、仪器简单、分析简便快速。 一般用化学发光分析仪检测。 常用化学发光剂：鲁米诺（luminol）、吖啶酯等。1、化学发光免疫测定（chemiluminescent immunoassay，CLIA） 发光剂标记抗体或抗原。2、电化学发光免疫测定（electro chemiluminescent immunoassay，ECLIA）,五、免疫胶体金标记技术 免疫胶体金标记技术（immunogic colloidal gold signature，ICS）。 胶体金（colloidal gold）：金盐被还原成原金 后形成的金颗粒悬液。四氯金酸（HAuCl4）在 柠檬酸钠等还原剂作用下聚合形成；一般大小 1-100nm，直径5-20nm呈葡萄酒色，20-40nm 呈深红色。在碱性环境下带负电荷，与抗体等 带正电荷的蛋白分子牢固结合而标记蛋白。 高电子密度等特性。 免疫金（immunogold）：胶体金与抗体（抗原） 的结合物。常见方法,1、免疫胶体金组织化学技术 因高电子密度特性可借助显微镜观察，定性、定 位测定组织或细胞中抗原。 2、免疫胶体金测定技术（1）液相法：凝集试验等（2）固相法i、斑点免疫金银染色法（dot-IGS/IGSS） dot-ELISA与免疫胶体金结合。 NC膜+待测蛋白抗原+特异性一抗+胶体金标记的 二抗（金颗粒聚集，形成肉眼可见的红色斑点即 dot-IGS，此时进行银显影液增强处理， 为dot-IGSS）。,ii、斑点免疫金渗滤测定法： 原理完全同于斑点免疫金银染色法，仅在NC膜下垫以吸水性强的垫料（渗滤装置）：加抗原后，迅速加入抗体和胶体金标记抗体。 特点：简便、快速、可立等结果。iii、斑点免疫金层析试验： 可设计成试纸条，检测简便、快速，但仅定性。 试纸条上端（A）和下端（B）均为吸水材料； D：含胶体金标记的特异性一抗 T：测试区，含另一种抗原特异性抗体 C：对照区，含与胶体金标记的抗体结合的二抗 结果判定：T、C均显示红色条带，阳性（+） 仅C显示红色条带，阴性（-） T、C均无显色，试纸条有问题,六、免疫标记新技术1、免疫-PCR（immuno-PCR） 1992年Sano建立，将抗原抗体反应与PCR结合起来。 以一段已知序列的DNA片段标记抗体，以PCR产物检测来检查抗原，为迄今最敏感的免疫检测方法，比现行ELISA敏感性高102-108。 步骤： 已知序列的DNA片段标记抗体： 一般为重组链霉亲和素-蛋白A（SA-SPA）嵌合体作为连接分子 抗原抗体反应 PCR扩增和产物检查,2、免疫传感器（1)原理： 以抗原抗体分子作为分子感应器，利用抗原抗体结合引起的直接或间接物理化学变化，通过信号转化（一般为光电信号），再经信号放大处理即可检测。（2）一般组成： 分子感应器、转导体和电子滤波放大处理器。（3）种类：非标记免疫传感器：抗体或抗原结合到转导体上，抗原抗体结合后，其结构发生变化，该变化可通过电化学、光学等变化表现出来，从而被检测。,标记免疫传感器：不直接检测抗体抗原反应，而是 检测免疫复合物上标记物的信号（如酶、荧光素、 放射性等），其敏感性高于非标记免疫传感器。 常见酶免疫传感器。 3、免疫芯片 在固相载体上的包被抗体或抗原的微点阵。 其实质：在很小表面积上有序地集成多种抗体或抗原，基于抗原抗体特异性反应进行检测。反应结果显示可用扫描仪或CCD摄像技术记录，通过计算机软件分析，综合成可读信息。 第一代抗体芯片Ab Microarray380:集成378种 抗体，可同时检测378种蛋白表达。,六、免疫分析在食品质量与安全检测中的应用食品分析检验：食品理化检验、食品卫生微生物检验、 食品营养素检验等。食品理化检验：物理特性、化学成分、有害金属与非金 属及化合物、农药残留物、兽药残留物、 真菌毒素测定等5个系列。1、农药残留的免疫分析2、兽药残留的免疫分析3、食品污染真菌毒素的免疫分析,第十三章 细胞免疫 检测技术,一、免疫细胞的分离1、外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC）：淋巴细胞、单核细胞 分离方法： 葡聚糖-泛影葡胺（Ficoll）密度梯度离心法： 免疫吸附分离法（Panning法，淘筛法） 免疫磁珠分离法 FACS 抗原肽-MHC分子四聚体技术2、腹腔巨噬细胞等分离,(1) 抗凝静脉血,(2) 加等量NS,(4) 密度梯度离心,(3) 混匀后，缓慢加于分离液上,密度梯度离心法,二、免疫细胞鉴定及功能检测1、E花环试验: 检测T细胞数量。 人T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞（SRBC）受体（E受体，CD2），故在一定条件下，SRBC能结合在淋巴细胞表面，形似玫瑰花环（E-花环），常用于测定T细胞数量。 Erythrocyte,红细胞,T细胞,SRBC,2、淋巴细胞转化试验: 了解T细胞的增殖能力。 T淋巴细胞表面具丝裂原(PHA等)受体,在PHA作用下发生活化,进入有丝分裂期从而增殖(淋巴细胞转化,形成淋巴母细胞):DNA倍增,染色质疏松,核仁明显,核增大;细胞体积增大,胞浆丰富等。可了解机体细胞免疫状态。检测方法:形态学法;同位素法(3H-TdR) 形态学法;,静止的淋巴细胞,转化的淋巴细胞,淋转试验,同位素法(3H-TdR): 将单个核细胞中加入PHA共同培养，在终止培养前8-15小时加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR), 经-液体闪烁仪检测淋巴细胞DNA的3H-TdR掺入量，推测淋巴细胞增殖的程度。,3、淋巴细胞的细胞毒试验（51Cr释放法）：检测淋巴 细胞对靶细胞的杀伤作用。,5、