研究生反转录病毒

南京医科大学微生物学与免疫学系卢 春,反转录病毒（Retrovirus）,（Retrovirus containing reverse transcriptase）,分类,RNA肿瘤病毒亚科（Oncovirinae）,HTLV-I、II型,慢病毒亚科（Lentivirinae）,HIV-1/2,泡沫病毒亚科（Spumavirinae）,人类泡沫病毒,反转录病毒分类,反转录病毒所具有的共同特性,AIDS病毒分子结构,第一节 人类免疫缺陷病毒概述,（1）1983年，Montagnier(蒙塔尼耶 )和Sinoussi(西诺斯 ) 首次分离到该病毒 (2008年度诺贝尔生理学或医学 奖 )；1984年Gallo也分离到相同病毒；,（Human Immunodeficiency Virus）,（2）1986年，ICTV正式命名为HIV，该病毒目前分 为两个血清型：HIV-1（全世界流行）和HIV-2 （最初流行于西部非洲）；（3）HIV感染引起以机会性感染和肿瘤为特征的获得 性免疫缺陷综合征（Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS）；,中等球形颗粒,9.7Kb ss+RNA, 含3个结构基因 6个调节基因,有包膜，包膜表面含有gp 120 糖蛋白 gp 41 糖蛋白,第二节 HIV形态结构,基因组：两条单正链RNA双体 核心酶蛋白：逆转录酶 整合酶 蛋白酶,衣壳蛋白：P7（核衣壳蛋白） P24 （衣壳蛋白） 内膜蛋白：P17脂质双层膜：包膜糖蛋白 gp41 gp120,全长9.75Kb：5-LTR-3个结构基因和6个调节基因-LTR-3 5 、 3 端长末端重复序列（LTR）,5LTR3个结构基因和6个调节基因LTR3； 5 、 3 端长末端重复序列（LTR）,第三节 HIV基因组结构,gag：编码前体蛋白P55,酶解,P24：衣壳蛋白（CA）,P17：内膜蛋白,P15,酶解,P7 ：核衣壳蛋白,P9 ：Unknown,pol：编码逆转录酶 p66/51 整合酶 p32 蛋白水解酶 p10,env：编码病毒包膜糖蛋白gp41 gp120,3个结构基因,基因组：两条单正链RNA双体 核心酶蛋白：逆转录酶 整合酶 蛋白酶,衣壳蛋白：P7（核衣壳蛋白） P24 （衣壳蛋白） 内膜蛋白：P17脂质双层膜：包膜糖蛋白 gp41 gp120,tat：编码反式激活转录因子p14（增强病毒基因的转 录、转译）；rev：编码p19（增强gag、pol和env结构蛋白的合成）；nef：编码负调控蛋白p27（抑制病毒结构和调节基因 的表达）；vif：编码p23（增强病毒的感染性）；vpu和vpr：分别编码p16和p15（增强病毒复制）；LTR：含启动子、增强子和TATA序列,6个调节基因,HIV的复制,+ssRNA,+ssRNA:-ssDNA,-ssDNA:+ssDNA,+ssRNA,反转录酶+细胞的tRNA为引物,RNA酶H降解亲代RNA；反转录酶以-ssDNA为模板合成+ssDNA,Provirus前病毒,整合酶将dsDNA整合到细胞染色体,NF-KB和LTR的作用,用作病毒基因组,合成结构蛋白,HIV-1基因转录体（本）的拼接模式,HIV-1 gp120和gp41在病毒包膜或细胞膜表面的折叠模式,HIV-1 Tat的不同功能域,HIV-1 Tat蛋白反式激活作用的两种模式,HIV-1 LTR中的转录调控元件,培养特性,敏感细胞：CD4+T细胞和巨噬细胞以及T细胞株 （CEM和H9）；敏感动物：恒河猴和黑猩猩为动物模型；,抵抗力,病毒对理化因素的抵抗力较弱；56 10 min灭活；在室温保存7天仍保持活性；对消毒剂和去污剂亦敏感；,第四节 HIV生物学特性与变异,病毒的变异,主要是env和nef的变异：（1）根据env的基因序列可以将HIV-1分成8个 亚型：A、B、C、D、E、F、H和O；（2）env基因每个核苷酸的突变率：0.1%，与 流感病毒的突变率相似；（3）病毒能够逃避机体的免疫力，形成持续 感染，给疫苗的研制和抗病毒药物的治 疗造成困难；,（1）传染源：患者和无症状携带者，从其血液、 精液、阴道分泌液、眼泪、乳汁、 脑脊液和唾液等均含病毒；（2）传播途径：血液、性接触、垂直传播,第五节 HIV致病性,病毒致病性,血液： 通过输血、血液制品或没有消毒好的注射 器传播，静脉吸毒者共用不经消毒的注射 器和针头造成严重感染，如我国云南边镜 静脉吸毒者感染率达60%，同时还包括器官 移植、人工授精； 性接触： 同性及异性间的性接触感染，美国及西方 国家主要以同性间性传播为主，非洲及东 南亚地区以异性间性传播为主；垂直传播：包括经胎盘、产道和哺乳方式传播（胎盘 感染最多）。,HIV感染临床表现包括原发感染急性期、无症状潜伏期、AIDS相关综合征及典型AIDS四个阶段 1）原发感染急性期：病毒感染机体后开始大量 复制，引起病毒血症，此时期从血液、脑脊液 及骨髓细胞可分离到病毒，从血清中可查到 HIV抗原。临床上可出现发热、咽炎、淋巴结 肿大、皮肤斑丘疹和粘膜溃疡等症状。持续12 周后HIV感染进入无症状潜伏期。,临床表现与分期,2）无症状潜伏期：此期持续时间较长，最长可 达10年。临床无症状，也有些患者出现无痛性 淋巴结肿大。此期患者外周血中一般不能或很 少检测到HIV抗原，这表明长期无症状的临床 过程与病毒持续在体内进行低水平的复制有关。 随着感染时间的延长，当HIV大量在体内复制 并造成机体免疫系统进行性损伤时，则出现临 床症状，即为AIDS相关综合征（AIDS-related complex，ARC）。3）AIDS相关综合征：出现发热、盗汗、全身倦 怠、慢性腹泻及持续性淋巴结肿大等症状。,4）典型AIDS：主要表现免疫缺陷症的合并感染 和恶性肿瘤的发生。由于AIDS患者机体免疫力 低下，一些对正常机体无致病作用的病原生物 常可造成AIDS患者的致死感染，如真菌（白色 念珠菌）、细菌（分枝杆菌）、病毒（巨细胞 病毒、人类疱疹病毒-8、EB病毒）、原虫（卡 氏肺孢虫）等感染症。部分病人可并发肿瘤， 如Kaposi肉瘤、恶性淋巴瘤、肛门癌、宫颈癌 等。也有许多患者出现神经系统肿瘤。疾患，如AIDS 痴呆综合征等。感染病毒10年内发展为AIDS的 约占50%，AIDS患者于5年内死亡率约占90%。,艾滋病病人与卡波氏肉瘤,上腭,下腭,1）HIV-1感染人体细胞，要求2个受体的共同作用： （1）病毒选择性的吸附于靶细胞的CD4受体；（2）gp120的V3区与靶细胞的辅助受体结合，引起 gp41与靶细胞膜融合，使病毒核衣壳进入宿主细 胞；2）嗜巨噬细胞毒株的辅助受体：CCR53）嗜T细胞毒株的辅助受体：CXCR4,病毒感染受体,1、检测抗体：ELISA方法进行初筛，检查HIV-1和 HIV-2抗体（我国卫生部将窗口期通常 定为3个月）； 如果为阳性还必须再 通过市或省CDC的 Western blot进行确诊 （HIV与HTLV之间存 在交叉抗原）。,第五节 HIV感染微生物学检查,2、病毒分离鉴定：分离正常人PBMCs（或传代 T细胞株H9、CEM），PHA 刺激3-4天，加入患者血液、 精液等标本，2-4周，观察 CPE（多核巨细胞），并用 IFA检测HIV P24抗原。3、病毒蛋白抗原检测：ELISA检测病毒衣壳抗 原P24（急性期阳性、潜 伏期阴性、典型AIDS期 又为阳性）。4、核酸检测：PCR检测前病毒DNA、RT-PCR检 测血浆中病毒RNA。,AIDS的流行病学,1981年 全球首例艾滋病病例在美国被发现； 1985年 中国首例艾滋病病例在协和医院被发现； 目 前 全世界共有艾滋病病毒携带者和患者5000 万，其中，4000万在撒哈拉沙漠以南的非 洲地区。,第一节 AIDS的全球流行概况,我国HIV-1感染数量达100余万（官方数据）为此，国家已将AIDS列为极为重要的性传播疾病，并于2005年在原有基础上增加了2亿元人民币专门用于AIDS的预防和治疗。,第二节 AIDS我国流行概况,2005,AIDS的防治,一、核苷类似物：抗逆转录酶活性 AZT（齐多夫定：zidovudine） ：首选 ddC（扎西它滨：zalcitabine） ：不及AZT ddI（去羟肌苷：didanosine） ：对AZT耐药和 无效者用 d4T（司他夫定：stavudine） ：不能应用AZT、 ddT者可采用 3TC（拉米夫定：lamivudine） ：用于耐AZT者二、蛋白酶抑制剂：RO-31-8959、ABT-538,第一节 HIV的化学药物治疗,三、整合酶抑制剂：（HIV-1整合酶为AIDS治疗的新靶点，病毒整合酶抑制剂因子是抗艾滋病药物设计的新战略）1. DNA结合剂：氯喹，ditercalinium ；2. 拓扑异构酶抑制剂：阿霉素、玫瑰树碱、懈皮素；3.肽类抑制剂：MAP30、GAP31；4.核苷类：AZT单磷酸衍生物（AZTMP）、T30117；5.多羟基化的芳香族化合物：金精二羧酸（ATA）、 咖啡酸苯乙基酯（CAPE）、双儿茶酚胺等；,HIV的DNA疫苗多以病毒的结构蛋白基因如env（编码gp120）、gag-pol-env和调节基因如nef、rev、tat为免疫靶来诱导机体的CTL反应，目前呈现发展env、rev、gag、pol复合DNA疫苗的趋势。多采用病毒基因结构中保守性较高的序列，以避免基因变异导致的免疫逃避问题。,第二节 HIV的DNA疫苗,1、vif ORF具有高度保守性，可诱导人体产生对HIV- 1有破坏作用的细胞免疫应答； 2、env基因序列可诱发特异的Th1型细胞免疫，用于 免疫恒河猴，可分离到gp120特异性、MHC-限 制性T细胞，识别gp120 C末端的第二个高变区， 活化后分泌IFN-和IFN-（不分泌IL-4）；,3、HIV-1 gp160 DNA疫苗：编码膜蛋白gp160的DNA 质粒+rev基因+gag-pol基因：在黑猩猩身上试验成 功，具有保护作用。2003年前在瑞士和美国宾夕 法尼亚进行/III期临床试验（promising），然 而，2003年4月已经证实该疫苗在人体上的实验是 失败的； 4、 细胞因子的加强作用：以IL-18作佐剂，显著提高 IL-2、IFN-，促进T细胞增殖产生三种抗病毒蛋 白的细胞毒反应，抗gag、tat抗体水平明显降低。,1、减毒HIV（nef）疫苗：短尾猴试验，免疫保护 作用不理想；2、HIV-1 gp120缺陷的减毒株全灭活疫苗(gp120)： 加不完全弗氏佐剂，诱导Th2反应，佐剂剂量越大， IL-4、IgG升高及IFN-降低越明显；加 DetoxTMPC，则引起较高的Th型应答；,第三节 HIV灭活疫苗、减毒活疫苗与蛋白疫苗,3、猴/人免疫缺陷嵌合病毒（SHIV）：是在SIV基因 组框架的基