实验项目黄酮提取

实验项目：木芙蓉花中有效成份提取与性能研究,主讲教师：倪明,一、目的与要求,1了解植物中有效成份的药用价值。2掌握植物中有效成份的提取及其测定方法。3掌握抑制亚硝化反应的操作与方法。,二、实验原理与相关知识,黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环（A-与B-环）通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮。是一大类以苯色酮环为基础的酚类化合物。植物中由苯丙氨酸产生的肉桂酰辅酶A，经碳链延长环化生成的查耳酮，再衍生成的各种-苯基衍生物。,二、实验原理与相关知识,黄酮类化合物结构中常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团。此外，它还常与糖结合成苷。天然黄酮类化合物多以苷类形式存在，并且由于糖的种类、数量、联接位置及联接方式不同可以组成各种各样黄酮苷类。组成黄酮苷的糖类包括单糖、双糖、三糖和酰化糖。黄酮苷固体为无定形粉末，其余黄酮类化合物多为结晶性固体。黄酮类化合物不同的颜色为天然色素家族添加了更多色彩。这是由于其母核内形成交叉共轭体系，并通过电子转移、重排，使共轭链延长，因而显现出颜色。黄酮苷一般易溶于水、乙醇、甲醇等极性强的溶剂中；但难溶于或不溶于苯、氯仿等有机溶剂中。糖链越长则水溶度越大。黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基，故显酸性。酸性强弱因酚羟基数目、位置而异。黄酮类化合物广泛存在于天然产物中，大多具有明显的抗炎、抗菌、生物抗氧化性、抗衰老、降血脂、治疗心血管疾病等功能。其中有些可用于心血管病的治疗。,二、实验原理与相关知识,植物单宁(Vegetable tannins)，又称植物多酚(Plant Polyphenol)为多羟基苯，如苯二酚、苯三酚等，是一类广泛存在于植物体内的多元酚化合物。在维管植物中的含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素，广泛存在于植物的皮、根、叶、果中，含量可达20%。植物单宁是植物的次生代谢产物，属于天然有机化合物。常是植物及微生物中产生的酚类次生代谢产物。具有抗氧化性、抗肿瘤、抗动脉硬化、防冠心病与中风等心脑血管病以及抗菌等多种生理功能，是自然界和人类的“健康卫士”。2l世纪随着抗氧化剂理论及研究工作的深入，以及消费者对食品安全性意识的提高，天然抗氧化剂的应用越来越受到人们的重视，回归大自然已是目前一个大趋势。木芙蓉（Hibiscus mutabilis L.）为锦葵科植物，又名拒霜花、木莲、醉芙蓉，为落叶灌木或小乔木。其花大色艳，花色一日三变，在寒凉的深秋傲霜怒放，观赏价值极佳。其花、叶、根富含生化药物成分，是极优良的中药材。中医认为，木芙蓉性平味辛，有清热、凉血、解毒、消肿、排毒之功效，适用于肺热咳嗽、月经过多、白带过多、痈疽肿毒、疔疮、水火烫伤等疾病。本草纲目言其“治一切大小痈疽，肿毒恶疮，消肿，排脓，止痛”。木芙蓉花、叶中含有多酚、黄酮类化合物。,二、实验原理与相关知识,1.测定总黄酮的原理:在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在条件下,黄酮类化合物先与亚硝酸钠发生氧化还原反应， 再加硝酸铝络合，最后加氢氧化钠溶液使黄酮类化合物开环，生成 2-羟基查耳酮而显红橙色,在510 nm波长处有吸收峰且符合定量分析的比尔定律,一般与芦丁标准系列比较定量（它的显色原理发生在黄酮醇类成分邻位无取代的邻二酚羟基部位,不具有邻位无取代邻二酚羟基的黄酮醇类成分加入上述试剂时是不显色的）。,二、实验原理与相关知识,2.多酚测定原理:总多酚的测定采用Folin-Ciocalteu法测定总多酚含量，其反应原理为酚类化合物在碱性条件下可以将钨钼酸还原，生成蓝色的化合物，颜色的深浅与酚类化合物含量呈正相关，在波长760 nm左右有最大吸收，一般与没食子酸标准系列比较定量。,二、实验原理与相关知识,3.总黄酮对亚硝酸钠清除率的测定亚硝酸钠在弱酸性条件下，与对氨基苯磺酸重氮化，然后再与盐酸萘乙二胺偶合生成红色化合物，用分光光度计测出该化合物的吸光度，就可知道反应液中亚硝酸钠含量多少。据此可以通过测定相同条件下亚硝酸钠含量的变化反映总黄酮清除能力的强弱，亚硝酸钠含量少，总黄酮清除能力就强，反之则弱。,二、实验原理与相关知识,4.总黄酮对亚硝胺合成阻断率的测定二甲胺与亚硝酸钠在模拟人体胃液的条件下(pH 3.0，温度37)，可适宜地生成二甲基亚硝胺。当往样品溶液中依次加入二甲胺与亚硝酸钠时，样品溶液优先同亚硝酸钠作用，使得二甲胺不能与亚硝酸钠反应，达到阻止亚硝胺生成的目的。据此可以通过比较相同条件下生成亚硝胺量的多少反映总黄酮阻断能力的强弱，生成亚硝胺量少，总黄酮的阻断能力就强，反之则弱。在紫外灯照射下，二甲基亚硝胺可分解成二甲基仲胺和亚硝酸根，亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后，再与1-萘胺偶合生成红色化合物，用分光光度计测出该化合物的吸光度，就可知道上述反应液中亚硝胺含量多少。,三、仪器与试剂,（一）实验室提供下列仪器和试剂1、仪器：电子分析天平；粉碎机；数显恒温水浴锅；三用紫外仪；真空泵；分光光度计；电热套；比色管；常用玻璃仪器。2、试剂：木芙蓉花采自湖北师范学院校区；芦丁（上海展云化工有限公司）；对氨基苯磺酸（分析纯）；柠檬酸（分析纯）；磷酸氢二钠（分析纯）；盐酸萘乙二胺（分析纯）；二甲胺（分析纯）；1-萘胺（分析纯）；钨酸钠（分析纯）；钼酸钠（分析纯）；没食子酸（分析纯）；（分析纯）；乙醇（分析纯）；A1(NO3)3（分析纯）；盐酸（分析纯）；NaOH（分析纯）；浓H2SO4（分析纯）；磷酸（分析纯）。,三、仪器与试剂,（二）学生自配及标定试剂1、乙醇溶液：60 %、80 %乙醇溶液。2、10% A1(NO3)3溶液。3、1 %三氯化铝溶液。4、2FeCl3溶液。5、5 % NaNO2溶液。6、4 % NaOH 溶液；1 % NaOH 溶液。7、5的醋酸铅溶液。8、1KMnO4溶液。9、10 % 、0.5% Na2CO3溶液。10、pH3.0 的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液:4.11 mL0.2 mol/L磷酸氢二钠与15.89 mL0.1 mol/L柠檬酸混合即可。11、1 mmol/L 的二甲胺溶液。12、1% 、0.4 %对氨基苯磺酸溶液。13、0.1% 1-萘胺溶液。14、0.2% 盐酸萘乙二胺溶液。15、0.4 % 对氨基苯磺酸溶液。,四、实验步骤,一、样品的处理及提取1. 处理：新鲜木芙蓉花水洗后，于60烘干，粉碎机粉碎，过筛备用。2. 提取：精密称取干燥、粉碎的木芙蓉花粉末1.0000 g置于锥形瓶中，加入60 %乙醇溶液30mL，于60浸提2 h，滤去残渣，残渣洗涤2-3次，定容至100 mL，即得提取液。,四、实验步骤,二、样品测定1. 黄酮测定1.1 黄酮类物质的鉴定方法(1)盐酸一镁粉反应：取待测液1.0 mL放在测试瓶中，加入少许镁粉振摇，滴加几滴浓盐酸，观察反应现象。(2)氨水反应：取待测液1.0 mL放在测试瓶中，滴加几滴氨水振摇，观察反应现象。(3)硝酸铝反应：取待测液1.0 mL放在测试瓶中，滴加几滴硝酸铝振摇，观察反应现象。(4)三氯化铝反应：取待测液1.0 mL放在测试瓶中，滴加几滴1 %三氯化铝振摇，观察反应现象。,四、实验步骤,(5)氯化铁反应：在试管中加1 mL提取物，再加入1.0 mL的2FeCl3，观察反应现象。(6)浓硫酸反应: 在样品液中滴加少量浓H2SO4溶液，观察反应现象。(7)碱性试剂显色反应在样品液中加入5 % NaNO2溶液; 摇匀，旋转6 min 后，加入等体积10% A1(NO3)3溶液，6 min 后再加入4 % NaOH 溶液，混匀，用60 %乙醇稀释，观察反应现象。(8)与5的醋酸铅反应：在5的醋酸铅溶液中滴加数滴提取物，观察反应现象。(9)与1高锰酸钾溶液反应：在试管中加10 mL 1KMnO4，滴入34滴提取物，观察KMnO4溶液是否褪色。(10)与碱性试剂(1NaOH)反应：在1 mL提取物中加入05 mL的1NaOH，观察颜色变化。,四、实验步骤,1.2 黄酮类物质定量测定1.2.1 标准曲线的制备精密称取芦丁对照品10 mg，置50 mL量瓶中，加80%乙醇溶解至刻度，摇匀即得对照品溶液。分别精密吸取1.0 mL，2.0 mL，3.0 mL，4.0 mL和5.0 mL置于10mL比色管中，各加80%乙醇至5 mL，加5% NaNO2溶液0.5 mL，摇匀放置6 min，再加10 % A1(NO3)3。溶液0.5 mL，摇匀，再放置6 min，加4 % NaOH溶液4mL，摇匀放置15min，在510 nm波长处，以同法配制空白对照，测定吸光度值，得回归方程。,1.2.2 样品黄酮含量测定精密吸取提取液1.0 mL于10 mL比色管中，按“各加80 %乙醇至5 mL”起依法进行操作，同时精密吸取黄酮提取液1.0 mL于10 mL比色管中，加80 %乙醇至5 mL，再加1mL水，4 mL4 %NaOH溶液，作样品空白测定吸光度值。按回归方程计算样品黄酮提取得率。,四、实验步骤,2.多酚测定2.1 福林酚（Folin-Ciocalteu）试剂的配制称取100 g钨酸钠和25 g钼酸钠置于2L的磨口圆底烧瓶中，用700 mL蒸馏水溶解，再缓慢加入50 mL 85 %的磷酸和100 mL的浓盐酸，充分混匀，放入数粒玻璃珠，连接回流冷凝装置，文火回流10 h。用50mL蒸馏水冲洗冷凝管上的附着物，拆开冷凝管后加入150 g无水硫酸锂和几滴溴水（边加边摇晃），开口继续加热沸腾15 min，使溴水完全挥发为止，终点颜色为黄绿色。冷却后定容至1000 mL，过滤，储存于棕色瓶中，放入冰箱中保存备用。,四、实验步骤,2.2 制作没食子酸标准曲线精确称取0.070 g的干燥没食子酸标准品，用蒸馏水溶解，定容于100 mL的容量瓶中，配成浓度为700 mg/L的没食子酸溶液。然后分别精密吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 mL没食子酸标准溶液定容于50 mL容量瓶内，配成浓度为0-56 mg/L的系列标准溶液。再从各系列标准溶液中吸取1mL于25 mL比色管内，加10 mL蒸馏水，摇匀，再加1.5 mL Folin- Ciocalteu试剂，充分摇匀，立即加入6 mL 10 % Na2CO3溶液，混匀，加水定容，再混匀，然后在30下避光放置反应2 h，以试剂样为空白，在波长760 nm处测定吸光值，以吸光度值为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。,四、实验步骤,2.3 多酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu反应比色法取1mL提取稀释液（样液稀释10倍）于25mL比色管内，加10 mL蒸馏水，摇匀，再加1.5 mL Folin- Ciocalteu试剂，充分摇匀，立即加入6 mL10 % Na2CO3溶液，混匀，加水定容，再混匀，然后在30下避光放置反应2 h，以试剂样为空白，在波长760 nm处测定吸光值，根据绘制的标准曲线方程计算提取液中多酚含量(以没食子酸计)，经进一步计算即得多酚提取得率。,四、实验步骤,3.抑制亚硝化反应3.1 总黄酮对亚硝酸钠清除率的测定分别吸取50 mg/L的NaNO2标准液1.0 mL于6支25 mL比色管中，再分别加入提取液0.0、1.0 、2.0 、3.0 、4.0 、5.0 mL，加入pH3.0 的柠檬酸- 磷酸氢二钠缓冲液10 mL， 37条件下反应1h。加入质量分数0.4 % 对氨基苯磺酸2.0 mL，摇匀静置5 min，再加入质量分数0.2% 盐酸萘乙二胺1.0 mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀静置15 min。在确定的最大吸收波长max = 540 nm 处测定吸光度，并计算总黄酮对亚硝酸钠清除率。,四、实验步骤,3.2 总黄酮对亚硝胺合成阻断率的测定分别吸取总黄酮提取液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，于6支25 mL 比色管中。加入pH 3.0 的柠檬酸- 磷酸氢二钠缓冲液10 mL，1 mmol/L 的NaNO2 溶液1.0 mL，1 mmol/L 的二甲胺溶液1.0 mL，用蒸馏水稀释至刻度，在37条件下恒温1 h。用移液管吸取1.0mL 上述溶液加到7 cm2 培养皿中，加入质量分数0.5% Na2CO3 溶液0.5 mL，于紫外分析仪(254nm 波长)上辐照15 min。取出后加入质量分数 1% 对氨基苯磺酸1.5 mL，再加入质量分数0.1% 1-萘胺1.5 mL，蒸馏水0.5 mL，摇匀静置15 min。用分光光度计在确定的最大吸收波长max = 525 nm 处测吸光度，计算总黄酮对亚硝胺合成阻断率。,四、实验步骤,1. 黄酮测定1.1 黄酮类物质的鉴定方法(1)盐酸一镁粉反应：取待测液10 mL放在测试瓶中，加入少许镁粉振摇，滴加几滴浓盐酸，产生泡沫反应，反应完后溶液呈橙红色，表明有黄酮类化合物。(2)氨水反应：取待测液10 mL放在测试瓶中，滴加几滴氨水振摇，反应完后溶液呈黄色，表明有黄酮类化合物。(3)硝酸铝反应：取待测液10 mL放在测试瓶中，滴加几滴硝酸铝振摇。反应完全后溶液呈黄色，表明有黄酮类化合物。(4)三氯化铝反应：取待测液10 mL放在测试瓶中，滴加几滴1 %三氯化铝振摇，反应完全后溶液呈黄色，表明有黄酮类化合物。(5)氯化铁反应：在试管中加1 mL提取物，再加入10 mL的2FeCl3，若呈蓝绿色或绿色，表明含有酚类化合物。,五、结果与分析,(6)浓硫酸反应: 在样品液中滴加少量浓H2SO4溶液，观察反应颜色变橙色，表明有黄酮类化合物。(7)碱性试剂显色反应在样品液中加入5 % NaNO2溶液; 摇匀，旋转6 min 后，加入等体积10% A1(NO3)3溶液，6 min 后再加入4 % NaOH 溶液，混匀，用65 %乙醇稀释，观察反应颜色变橙红色，表明有黄酮类化合物。(8)与5的醋酸铅反应：在5的醋酸铅溶液中滴加数滴提取物，有黄色沉淀产生的表示有黄酮类成分。(9)与1高锰酸钾溶液反应：在试管中加1.0 mL 1KMnO4，滴入34滴提取物，观察KMnO4溶液是否褪色，若褪色表明含有酚类化合物。(10)与碱性试剂(1NaOH)反应：在1 mL提取物中加入05 mL的1NaOH，观察颜色变化，若呈黄色、橙色或红色，表明含有黄酮类成分。,五、结果与分析,五、结果与分析,2.样品黄酮提取含量按照如下公式计算式中：Y：黄酮提取含量（%）；V：提取黄酮液体积（mL）；C：提取原液中黄酮的浓度（g/mL）；M：木芙蓉花质量（g）。,五、结果与分析,3. 多酚提取得率按照如下公式计算式中：Y：提取得率（%）；V：提取多酚液体积（mL）；C：提取原液中多酚的浓度（g/mL）；