荧光定量PCR技术临床应用

荧光定量PCR技术在临床医学研究中的应用及注意事项,内 容 提 要,一、基因诊断技术在医学检验中的地位二、荧光探针定量PCR在临床医学中的应用三、荧光探针定量PCR在临床医学中的主要问题,基因诊断的物质基础及与其它诊断方法的区别,基因诊断,免疫学诊断,临床诊断,细胞膜,细胞核,DNA,转录,mRNA,翻译,蛋白质,临床表现,生化诊断,临床实验医学发展,三个时代 标志技术 性质生化诊断时代 生化分析 表象免疫学诊断时代 酶免、放免 表象分子(基因)诊断时代 基因体外扩增(PCR) 本质,1、病原体的定量检测及药物疗效考评（HBV）2、肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测（P53 ）3、遗传病基因的检测（地中海贫血 ）4、与疾病相关的各种蛋白质的基因表达的定量检测6、建立病原体的分子诊断标准,荧光定量PCR在临床医学中的应用,荧光定量PCR在病原体检测中的应用,一、肝炎病毒定量检测二、性病病原体检测三、优生优育相关项目检测四、结核杆菌及呼吸道病原体检测五、其他病原体检测,病毒性肝炎概况,病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起，以肝脏炎症和坏死病变为主的一组传染病。按病毒的生物学特征、临床和流行病学特征，1989年在日本东京的国际肝炎学术讨论会上，将其分为甲（A）型、乙（B）型、（C）型、丁（D）型、戊（E）型肝炎，以后还报道了己（F）型和庚（G）型。 我国是个肝炎大国，病毒性肝炎发病数位居法定管理传染病的第一位，仅乙型肝炎病毒感染者就达1.2亿，每年新增加的感染者也在百万以上，丙肝发病率亦趋上升。慢性乙型肝炎病程迁延，如得不到及时的治疗，部分将会发展为肝硬化甚至肝癌，严重危害人类健康。,HBV基因型与血清型关系及流行病学分布,病原学,乙型肝炎检测标志物,HBsAg，抗-HBsHBeAg，抗-Hbe抗HBcHBV-DNA,乙型肝炎免疫检测和PCR结果异同,“大三阳” PCR结果阴性抗-HBs阳性，PCR结果阳性,荧光定量PCR技术对性传播疾病的检测,一、淋球菌（NGH）二、沙眼衣原体、解脲脲原体（CT、UU）(有证）三、梅毒螺旋体（TP）四、单纯庖疹病毒（HSV）五、乳头瘤病毒（HPV）（有证）六、人类免疫缺陷病毒（HIV）,PCR技术对性传播疾病检测的注意事项,1标本的选取 TP HSV 2临床疗效考评,超高倍,荧光定量PCR诊断TORCH综合征,传统的TORCH病原体：TOX, other, RV, CMV, HSV新近发现的TORCH：麻疹V、腮腺炎V、水痘带状 庖疹V、肠道V、乙肝V、丙肝V、 HPV、EBV、HIV、人庖疹V6、 人微小病毒B19等,TORCH感染的实验室诊断,一、组织培养：慢，费力，阳性率低二、血清学诊断： IgG： IgM： 1、不能定量分析 2、抗体的产生受多种因素的影响 3、产生假阳性三、基因诊断方法 原理：检测TORCH病原体的核酸 优点：1、客观指标 2、敏感性、特异性高 3、定量指标 荧光定量PCR在TORCH诊断中的应用： 1、筛选TORCH的患者 2、建立TORCH的分子诊断标准,荧光定量PCR技术检测TOX,孕妇TOX感染的危害 孕早期（多少，也可对样本稀释后再检测；如低于此范围，则报告多少，如103拷贝数/ml，而不能报告为0拷贝数/ml或阴性。拷贝数与病原体的关系：拷贝数与病原体的数量成正相关 。一般来说细菌是多拷贝的，病毒是单拷贝的。DNA拷贝数单位和质量单位：100拷贝HBV0.04fg国际单位IU,拷贝数/ml的确定：,DNA/RNA 参考品（质粒等）,测量OD260的值得到mg/ml,通过与分子量的计算，得到拷贝数/ml,不同实验室得到的结果差别很大。,HCV国际单位与拷贝数换算,NGI SuperQuant: 1 IU/mL = 3.4 copies/ml (NGI Product License Application to FDA )Roche Amplicor Monitor v2.0 1 IU/mL = 0.9 copies/ml (Roche Molecular Systems)Cobas Amplicor Monitor HCV v2.0 1 IU/mL = 2.7 copies/ml (Roche Molecular Systems)LCx HCV RNA Quantitative Assay 1 IU/mL = 3.8 copies/ml (Abbott Diagnostics)Bayer bDNA 3.0: 1 IU/mL = 5.2 copies/ml (Bayer Development Group),未知HCV RNA 样本,甲实验室 5000拷贝/ml,乙实验室 10000拷贝/ml,丙实验室 50000拷贝/ml,丁实验室 20000拷贝/ml,实验室结果的互通性,20000IU/mlHCV RNA 样本,甲实验室 40000拷贝/ml1IU/ml2拷