猪瘟活疫苗-刘彦龙

,猪瘟活疫苗制备方法及相关知识 刘彦龙,目录,猪瘟简介,猪瘟简介,猪瘟俗称“烂肠瘟”，是由黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒引起的一种急性、发热、接触性传染病。以出血和发热为主要特征，并引起妊娠母猪流产、胎儿畸变、慢性营养性消耗、淋巴细胞和血小板减少等免疫系统受损、继发或并发细菌或其他病毒感染等临床表现，呈急性或慢性经过，是一种对猪危害性极大的传染病，被国际兽疫局(OIE)列为必须上报的疾病。,特征是：急性，呈败血性变化，实质器官出血，坏死和梗死；慢性呈纤维素性坏死性肠炎，后期常有副伤寒及巴氏杆菌病继发。是猪的一种急性接触性传染病，又称猪霍乱。1885年首先在美国发现，以后传播到世界各大洲。中国大部分省都有发生。1903年美国兽医学家德希尼兹和多赛特鉴定本病的病原是黄病毒科的瘟病毒属（Pestivirus）中的猪瘟病毒。主要通过直接接触，或由于接触污染的媒介物而发病。消化道、鼻腔粘膜和破裂的皮肤均是感染途径。一年四季都可发生，以春夏多雨季节为多。,猪瘟简介,猪瘟发现历程：猪瘟于1833年首先发现于美国的俄亥俄州。1885年，Salmon和Smith等对猪瘟和沙门氏菌病及猪丹毒作了鉴别诊断。1903年，DeSchweinitz和Dorset两氏证明猪瘟的病原体是病毒。匈牙利的Hutyra Koves于1908年制成猪瘟高免血清，说明那时欧洲已存在猪瘟。日本于1909年第一次发现并开始研究猪瘟（Sasahara，1970）。中国何时发现和证明猪瘟存在，没有明确的文字记载。约于1925年，东南大学农科开始研制免疫血清防制猪瘟。,猪瘟简介,猪瘟病毒（HCV或CSFV）是ssRNA病毒，黄病毒科瘟病毒属，其RNA为单股正链。病毒粒子呈圆形，大小为3844nm，核衣壳是立体对称二十面体，氯化铯中浮密度1.151.17g/ml，有包膜。猪瘟病毒在细胞质内复制,不能凝集红血球，与牛腹泻病毒有相关抗原。该病毒对乙醚敏感，对温度、紫外线、化学消毒剂等抵抗力较强。猪瘟病毒能在猪胚或乳猪脾、肾、骨髓、淋巴结、白血球、结缔组织或者肺组织的细胞中培养，也可在传代细胞中培养如：PK-15，但在这些细胞上不产生明显病变。,病原学,猪瘟病毒的基因结构：CSFV为有囊膜病毒，40-60 nm，单股正链RNA。CSFV基因组长约12.3 kb，仅含有一个大的开放性阅读框架（ORF）。此ORF翻译成含3898个氨基酸残基，分子量约438 kDa的多聚蛋白，并进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工为成熟蛋白CSFV的所有结构蛋白和非结构蛋白均由该ORF所编码。ORF两侧是5一端非翻译区（5-UTR）和3一端非翻译区（3-UTR）且5一端无帽子结构3一端无poly(A）尾巴。这一大前体蛋白以共翻译和后翻译的形式在细胞蛋白酶和病毒特异蛋白酶作用下加工成结构蛋白和非结构蛋白，其结构蛋白和非结构蛋白在病毒RNA上的编码顺序为Npro、c、Erns(E0）、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、 NS5A、NS5B。NS2-3可被加工成NS2、NS3(P80），除C、E0、E1和E2为结构蛋白外其余均为非结构蛋白。,病原学,目前已经定位的CSFV蛋白有5种，即 Npro、C、Erns(E0）、E1和E2它们均由CSFV的 RNA-ORF5一端所编码。在结构蛋白中，最具有免疫防制研究价值的是EO和E2。 HCV病毒囊膜有55ku和46ku两种糖蛋白，核衣壳则为36ku蛋白质构成。HCV和同属的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的基因组序列有高度同源性，抗原关系密切，既有血清学交叉反应，又有交叉保护作用。HCV为单一血清型，尽管分离不少变异株，但都属于一个血清型。HCV野毒株毒力差异很大，有强、中、低、无毒株以及持续感染毒株之分。强毒株引起死亡率高的急性猪瘟，中毒株一般产生亚急性或慢性感染，低毒力猪瘟病毒可感染胎儿引起轻微临诊症状或亚临诊感染，但胚胎感染或初生猪感染可导致免疫失败和死亡。无毒力株能引起高度病毒血症，但不表现任何临诊症状，呈持续感染。,病原学,HCV对环境的抵抗力不强，但存活的时间部分取决于含毒的介质。血液中的病毒在5660min可被灭活，6010min可使其完全丧失致病力。而脱纤血中的病毒在6830min尚不能灭活。病毒在冻肉及其制品中可以存活6个月之久。在猪粪便中HCV于20可存活2周，4可存活6周以上。病毒对乙醚、氯仿和去氧胆酸盐等脂溶剂敏感。病毒在PH510条件下稳定，过酸或过碱能使病毒失活，氢氧化钠、漂白粉等溶液中很快失活，2%的氢氧化钠仍是最合适的消毒剂。,病原学,一、临床症状 根据病程长短、临床症状和特征的不同分为：最急性型、急性型、亚急性型、慢性型、温和型和迟发型。1、潜伏期5-7天，体温升高持续41度左右2、眼结膜潮红，眼角有多量粘性或脓性分泌物。注意:清晨两眼黏合3、全身有许多出血斑4、公猪包皮积尿5、病猪前期便秘，后期腹泻6、死亡率50%以上目前单纯的猪瘟感染病例比较少见，常与蓝耳、伪狂、链球等多种疾病混合感染，其临床表现既有猪瘟的症状，又有其他疾病的症状，各种症状都不典型，但大多数猪的皮肤上都有出血点或出血斑。,症状及病理,二、剖检病变 猪瘟病毒主要是损伤小血管内皮细胞，引起组织器官出血，对猪瘟有诊断意义，特别是皮肤、肾脏、淋巴结、脾脏出血。1、皮肤出血多见在颈部、腹股沟、四肢内侧2、全身性出血性淋巴结炎表现非常突出。尤以颌下淋巴、腹股沟淋巴、肠系膜淋巴最为明显。淋巴结肿大呈暗红，切面湿润多汁，隆突，边缘的髓质呈鲜红色或暗红色，围绕淋巴结中央皮质并向皮质内伸延，形成大理石花纹，整个淋巴结严重出血时犹如血肿，切面见淋巴组织几乎全部被血液取代。此种变化对猪瘟有一定的诊断意义。3、肾脏肿大，色泽变淡，表面散步数量不等的点状出血，多则密布整个表面，形似麻雀蛋外形，故称为雀蛋肾，切面无论皮质或髓质都可以见得到针尖大至粟粒大的出血点。,症状及病理,症状及病理,4、脾脏通常不肿大或轻微肿胀，脾脏边缘数量不等的粟粒大至黄豆大暗红色不正圆形的出血性梗死灶，这又是猪瘟的特征性病变。5、各粘膜、浆膜和器官的出血也很明显，尤其是泌尿生殖道和呼吸道。膀胱、喉头部的出血病变在其他传染性疾病所致的败血症过程中比较少见。类证鉴别：1、临床上，猪瘟与丹毒、猪肺疫、副伤寒、弓形体有许多类似之处。2、丹毒：多发于夏天，病程短，抗生素治疗效果显着。3、猪肺疫：咽喉部急性肿胀，呼吸困难，口流泡沫，咳嗽，皮肤发红，有少数出血点4、副伤寒：一般是幼畜病，在阴雨绵绵的季节多发，先便秘后下痢，眼结膜、胸腹部皮肤呈蓝紫色。解剖时，肠系膜淋巴结显着肿大。5、弓形虫：呼吸高度困难，磺胺类药物治疗有效，淋巴结肿大并伴发灶状坏死。,淋巴结出血,症状及病理,肢端皮肤斑点出血，包皮皮肤出血,盲肠、结肠粘膜上形成纽扣状溃疡A或互相形成较大的溃疡坏死B,流行特点：本病在自然条件下只感染猪，不同年龄、性别、品种的猪和野猪都易感，一年四季均可发生。病猪是主要传染源，病猪排泄物和分泌物，病死猪和脏器及尸体、急宰病猪的血、肉、内脏、废水、废料污染的饲料，饮水都可散播病毒，猪瘟的传播主要通过接触，经消化道感染。此外，患病和弱毒株感染的母猪也可以经胎盘垂直感染胎儿，产生弱仔猪、死胎、木乃伊胎等。,诊 断,1、临床诊断在规模化猪场，如猪群中先后或同时有几个或更多的病猪出现高热不退，精神高度沉郁，食欲减退，全身衰弱，后躯无力，粪便干燥，后期拉稀，呈黄色、绿色不等，有时带血，皮肤的薄皮有出血点，耳朵发紫，死亡率较高，可初步判断为疑似猪瘟。2、尸体剖检典型猪瘟病理解剖学变化，在现场即可做出正确判断，如见全身淋巴结呈现出血性淋巴结炎，切面呈大理石样外观，皮肤有出血斑点，肾贫血有点状出血，脾不肿大，有出血梗死，膀胱、喉头粘膜及心外膜和胃肠浆膜有出血点。慢性型猪瘟大肠有扣状肿，然后结合临床流行病学调查进行分析，通常可做出诊断。3、动物接种试验易感猪接种是检测猪瘟病毒的最敏感方法。采取发病猪的血液或病死猪的淋巴结、脾脏、扁桃体等组织制成乳剂，无菌处理后接种易感猪（10-20Kg），观察发病情况，然后再分离病毒。通常采用兔体交叉免疫试验。4、检测血清抗体检测血清抗体可为猪瘟免疫提供依据，特别是酶联免疫吸附试验对检测非典型猪瘟和温和性猪瘟有重要作用。,诊 断,5、检测猪瘟病毒直接免疫荧光抗体技术是检测猪瘟病毒的一种快速诊断方法，该方法是采取猪的扁桃体或者猪肾、脾等组织做冰冻切片或触片，经丙酮固定，荧光抗体染色，在荧光显微镜下观察，如果这些组织细胞内发现有亮绿色荧光，说明细胞内存在猪瘟病毒，即可诊为猪瘟。6.可利用鸡新城疫病毒强化试验（END试验)测定猪瘟病毒，作为诊断猪瘟的一种方法。,诊 断,疫苗和疫苗接种是控制猪瘟的重要手段，包括灭活疫苗和弱毒疫苗。各国都在努力 研究安全有效的疫苗。中国现推广应用免疫萤光技术和酶联免疫吸附测定法。采用抗猪瘟血清在病初可有一定疗效，此外尚无其他特效药物。中国的猪瘟兔化弱毒疫苗免疫期可达一年以上，已被公认为一种安全性良好、免疫原性优越、遗传性稳定的弱毒疫苗。,防治措施,无猪瘟的国家： 猪瘟遍布于全世界，具有高度接触传染性。由于各国的诊断和防 制手段比较认真，许多国家和地区已先后宣布消灭了猪瘟。根据1976年巴黎国际兽疫局的资料，已宣布无猪瘟的国家有：阿尔巴尼亚（1973），保加利亚（1975），丹麦（1933），芬兰（1971），英国（1971），匈牙利（1971），爱尔兰（1958），冰岛（1953）， 卢森堡（1971），挪威（1963），瑞典（1944），瑞士（1974），南斯拉夫（1973）。日本自1975年以来没有猪瘟病例，但在1980年又有多处暴发。美国也已宣布于1978年无 猪瘟病例发生。,猪瘟活疫苗制造及检验规程（细胞源）,毒种的繁殖,细胞的制备,制苗毒液的繁殖,半成品检验,配苗、分装、冻干,成品检验,猪瘟活疫苗制备工艺流程图,家兔饲养,接种,测温观察,达标家兔宰杀,牛睾丸采集,牛睾丸采集,5%保护剂制备,5%保护剂检验,种毒制备,牛睾丸细胞制备,接种睾丸细胞,收 获,包 装 瓶,清 洗,灭 菌,丁基胶塞,灭 菌,检 验,配 苗,分装加塞,冻 干,铝塑盖,包装 贴签,消 毒,轧 盖,入 库,1.毒种1.1 制造本品用的毒种为猪瘟兔化弱毒株；校检用强毒为猪瘟病毒石门系。1.2毒种标准猪瘟兔化弱毒株 通过兔体继代，采集定型热反应兔的脾脏作毒种。脾毒应符合以下标准：（1）对家兔的感染性： 将毒种用灭菌生理盐水作50倍稀释，耳静脉接种家兔4只，每只1ml。接种后测温观察96小时，仅使家兔产生热反应，不致死家兔。（2）最小感染量： 脾毒对家兔的最小感染量10-5/ml。（3）安全性： 用灭菌生理盐水作10倍稀释，肌肉注射健康易感猪4头，每头5ml。接种后每日上、下午各测体温、观察一次，观察21日。体温、精神、食欲应正常。,毒种繁殖,（4）免疫原性： 脾毒对猪的最小免疫量为10-5/ml。（5）纯净： 应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。（6）特异性： 将毒种（疫苗）用灭菌生理盐水稀释成每1ml含有100个兔的最小感染量的病毒悬液，与等量的抗猪瘟病毒特异性血清充分混合，置1015中和1小时，其间振摇23次。同时设立阳性对照（病毒对照）和阴性对照组（生理盐水）。中和结束后，分别接种家兔2只，每兔耳静脉注射1ml，观察体温。除阳性对照组应出现热反应外，其余两组在接种后120小时内不引起热反应。（7）基础种子代数： 为478490代。（8）毒种保存-70保存期为10年；在-30保存期为5年。,毒种繁殖,2.生产用毒种制备2.1毒种繁殖2.1.1家兔的选择 选用营养良好，体重1.53kg家兔。购入家兔应隔离饲养观察30日以上。 家兔接种前，至少应测温观察3日，每日上、下午各测温一次。选用体温正常、体温波动不大的家兔。2.1.2接种 将冻干毒种用灭菌生理盐水制成50倍稀释的乳剂，每兔耳静脉注射1ml。2.1.3测温观察 家兔接种后，上、下午各测温一次，24小时，每隔6小时测体温一次。2.1.4热型判定 接种家兔的体温分为四类：,毒种繁殖,毒种繁殖,（1）定型热反应（+）潜伏期2448小时，体温上升呈明显曲线，超过常温1以上，至少有3个温次，并稽留1836小时。（2）轻热反应（+）潜伏期2472小时，体温上升有一定曲线，超过常温0.5以上，至少有两个温次，稽留1236小时。（3）可疑反应（）潜伏期不到24小时，或超过72小时，或超过72小时以上，体温曲线起伏不定，或稽留不到12个小时，或稽留超过36小时而不下降。（4）无反应（）体温正常者。注：常温 家兔接种前3日所测体温的平均温度。潜伏期：由接种时算起，到体温上升超过常温0.5以上的间隔时间。稽留期：由体温上升超过0.5算起，到体温下降到常温或接近常温的间隔时间。2.1.5毒种的收获 选择定型热反应兔，从体温下降及其以后的24小时内剖杀。以无菌操作采取脾脏冷冻或冻干保存，作为生产用毒种。,毒种繁殖,2.2细胞毒的繁殖 用细胞维持液，将新鲜脾毒制成0.30.5%的病毒悬液，接种生长良好的牛睾丸或羊肾单层细胞，置3637继续培养。每隔45日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产毒种。2.2.1毒种的鉴定标准（1）对细胞的感染性 毒种接种牛睾丸或羊肾细胞均不致细胞病变。（2）对家兔的感染性 将毒种用灭菌生理盐水作50倍稀释，耳静脉接种家兔4只，每只1ml。接种后测温观察96小时，仅使家兔产生热反应，不致死家兔。（3）病毒含量 毒种对家兔的最小感染量为10-5/ml。（4）安全性 脾毒用10倍稀释乳剂，细胞毒用原液接种无猪瘟中和抗体的健康易感猪4头，每头肌注5ml，测温观察21日，应无异常反应。（5）纯净 毒种应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。符合以上标准的毒种作为生产用种子。2.2.2毒种保存 在-15以下保存，脾毒不超过25日；细胞毒不超过6个月。2.2.3毒种继带 脾毒不超过5代；细胞毒不超过3代。,细胞制备,3.制苗用细胞的制备3.1制苗用细胞 为犊牛睾丸或羔羊肾细胞。牛睾丸或羊肾应选用非猪瘟疫区，无口蹄疫、粘膜病等传染病地区的14日龄健康小公牛或10日龄以内的健康羔羊。3.2细胞的制备1、牛睾丸的采集和处理 犊牛经体表消毒，以无菌手术采取牛睾丸，放入含适宜抗生素的Hanks液或Earles液中，浸泡3040分钟，再用无菌操作除去被膜、副睾、肾盂、肾盏，将组织剪成12mm小块，用Hanks液或Earles液反复冲洗，至上清液清亮为止。2、消化 将组织块移入消化瓶中，牛睾丸加入5-8倍的0.25%胰酶溶液，塞紧瓶口，置37水浴消化，中间每隔10分钟轻摇一次，消化完毕除去胰酶溶液。3、细胞分散及培养 弃去胰酶溶液后，脱酶13次，再加入营养液，以玻璃珠振摇法或吹打法分散细胞，反复进行34次，用两层纱布滤过，收取细胞悬液，分装于培养瓶内，装量为瓶容积的1/10，塞紧瓶口，置3637进行旋转培养，转速为每小时1012转，培养的细胞一般于第35日长成致密单层。,细胞毒液的繁殖,4、细胞传代及检验 牛睾丸原代细胞长成单层后，用EDTA-胰酶细胞分散液消化，以（1:3）（1:5）制成次代细胞悬液，继续旋转培养35日，形成良好单层。同时将次代细胞悬液分装到检验用的小扁瓶和带盖玻片的林氏管中培养，按附注的规定，进行各项检测，应为阴性。 羊肾用原代细胞接毒制苗，同样应将其原代细胞按附注进行各项检测。3.3制苗毒液的繁殖3.1接毒 取已形成良好单层的牛睾丸次代细胞（羊肾原代细胞）培养瓶，弃去培养液，接种含35%生产用细胞毒种或0.20.3%脾毒种的维持液，置3637继续培养。3.2收获 接毒后5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液1次。3.3收获的毒液置-15以下保存，应不超过3个月。,半成品检验,1.无菌检验 各收次病毒培养液分别取样，应无菌生长。2.病毒含量测定 各收次病毒培养液分别用家兔测定，每1ml应含病毒50000个家兔感染量，方可用于配苗。3.用脾毒接种细胞制备的毒液，应用2头敏感猪做安全检验。,配苗及分装 将检验合格的病毒培养液，混合于同一容器内，按一定比例加入5蔗糖脱脂牛奶稳定剂，同时加入适宜的抗生素，充分摇匀，定量分装，每头份含细胞毒液不少于0.015ml。冻干 分装后迅速进行冷冻真空干燥。轧盖及贴签 将冻干后的样品迅速进行轧盖和贴签，放入成品冷库。,成品检验,1.物理性状 本品为乳白色海绵状疏松团块，易于瓶璧脱离，加稀释液后迅速溶解。2.无菌检验 应无菌生长。3.支原体检验 应无支原体生长。4.外源病毒检验 若生产用毒种和制苗用细胞系统已做过外源病毒检验，成品可免检。5.安全检验 用猪作安检。按 进行。6.效力检验 下列方法任选其一。1、用家兔效检 按瓶签注明头份用无菌生理盐水将每头份疫苗稀释750倍，耳静脉注射家兔2只，每只1ml。家兔接种后，上下午各测体温一次，48小时后，每隔6小时测体温一次，根据体温反应和攻毒结果进行综合判定。2、用猪效检 按瓶签注明头份，将每头份稀释300倍，肌肉注射无猪瘟中和抗体的健康易感猪2头，每头1ml。1014日后，连同条件相同的对照猪3头，注射猪瘟石门系血毒1ml（10-5最小致死量），观察16日。对照猪全部发病，且至少死亡2头，免疫猪全部健活或稍有体